Настоящее изобретение относится к но- полициклического простого эфира, имеюцым антибиотикам на основе кислотногощёго общую формулу
ОМе
0-Ме
МеО
Me ОМе
Me
fe
Использование: микробиология , получе- tnne полиэфирных антибиотиков, относящихся к кислотным полициклическим простым эфирам. Сущность изобретения: осуществляют глубинное культивирование штамма Actlnomadura sp. ATCC 53708 в условиях аэрации и перемешивания в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли. Куль- туральную жидкость или отфильтрованный мицелий экстрагируют органическим растворителем. Продукт выделяют в неочищенном или чистом виде или переводят в фармацевтически приемлемую соль щелочного металла. 1 табл.
Me Me
в которой Me представляет собой метиль- ную группу, имеющего абсолютное стерео- химическое строение, отраженное в формуле, к пригодным для фармацевтического использования катионным солям указанных соединений, к пищевым композициям, включающим указанный антибиотик и предназначенным для домашней птицы, крупного рогатого скота или свиней, к их использованию в качестве противокок- цидальных средств для домашней птицы, при лечении или предотвращении дизентерии у свиней, или в качестве стимулятора
е
Me
Me ОН ф
роста крупного рогатого скота и свиней, к способу ферментации для их получения, и к микроорганизмам Aetlnomadura, которые продуцируют указанный антибиотик согласно указанному ферментационному способу.
Соединение (I) представляет собой новое соединение ряда антибиотиков, относящихся k кислотным полициклическим простым эфирам. Этот ряд включает также такие широко известные агенты, как моне- з ин (Указатель фирмы Мерк, 10-е издание, Меркэнд Ко.Инкорпорейтед, Рэгуэй. Нью§
00
о о
si
СО
Джерси, 1983, № по указателю 6100), ниге- рицин (Указатель Мерк, № по указателю 6100), ласалоцид (Указатель Мерк № по указателю 6390) и салиномицин (Указатель Мерк,№ по указателю 8193). Этот вопрос освещен Уэстли, Полиэфирные антибиотики, т. 22, с. 177-223 (1977). Наиболее близким в структурном отношении аналогом указанного соединения является портм цин, антибиотик независимо описанный Хэ- миллом с сотр. в патенте США № 4572822 и Кусакабе с сотр. в европейской патентной заявке 158179, Tetrahedron Letters, 28, 3357-3360 (1987), J.Antiblotics 40, 237-238 (1987). Это соединение обладает альфа-водородным атомом в тетрагидрофурановом кольце В, тогда как соединение согласно настоящему изобретению имеет альфа-ме- тильную группу. Указанные соединения известны в качестве кокцидостатических средств, в качестве средств ускорения роста - добавок к пище, и/или в качестве агентов, противодействующих развитию дизентерии у свиней.
Культура Actinomadura sp. ATCC 53708 (АТСС 53708) при ферментировании в аэробных условиях в водной среде продуцирует новый антибиотик типа кислотного полициклического простого эфира - соединение общей формулы (I), описанное выше.
Настоящее изобретение относится к указанному соединению формулы (f), включая его пригодные для фармацевтического использования катионные соли, и к способу его получения, включающему ферментиро- вание указанных микроорганизмов Actinomadura sp. ATCC 53708 в водной питательной среде, включающей источник усваиваемого углерода и азота до образования извлечимого количества указанного соединения формулы (I), предпочтительно в погруженных аэробных условиях. Для его использования в качестве противококци- дального агента., средства для предотвращения или лечения дизентерии у свиней и/или в качестве средства ускорения роста, соединение (I) не обязательно выделять в практически чистом виде, напротив, его можно в альтернативном варианте, использовать в неочищенном виде, либо осажденным из смеси мицелием (с выделением из ферментативной среды фильтрованием), либо в твердой форме после сушки при распылении или замораживании всей ферментационной среды.
Указанные пригодные для фармацевтического применения катионные соли включают (но не ограничиваются) соли натрия, калия, кальция, аммония, NtN -дибензилэ- тилендиэминэ, N-метилглкжамина, (меглумина) и диэтаноламина. Предпочтительными катионными солями являются соли калия и натрия.
Культура, способная продуцировать антибиотик в форме полициклического эфира согласно настоящему изобретению, отвечающего формуле (I). обозначается Actinomadura, она помещена в Американской коллекции типов культур в Роквилле,
штат Мэриленд в качестве типовой культуры под номером АТСС 53708. Наличие депонированной культуры в Американской коллекции типов культур в Роквилле, Мэриленд, и возможность доступа к ней будут обеспече5 ны на протяжении всей продолжительности действия патента, если патент по настоящей заявке будет выдан. Доступ к культуре обеспечен в соответствии с действием заявки под номерами 37 CFR 1.14 и 35 USC 122.
0 Все ограничения для широкого использования депонированной культуры снимаются немедленно после выдачи соответствующего патента.
Указанная культура была получена из
5 образца почвы, взятого в Тузле (Стамбул, Турция), и идентифицирована в коллекции культур Пфайзер Инкорпорейтед под номером N 777-1. Ее описание и классификация обеспечены д-ром Д.Х.Хуангом.
0 Обнаружено, что указанная культура продуцирует тонкие нити грибницы (гифы) акти- номицетов, воздушный мицелий, на котором продуцируются цепочхи коротких спор, и неразделенный субстратный мице5 лий. Результаты полного анализа клеток указывают на то, что данный микроорганизм принадлежит к роду Actinomadura.
Культуру идентифицируют в соответствии с описанным ниже способом.
0 Экстракт дрожжей - солодовый экстракт агар-агар (среда /sp# 2, Дифко) рост хороший, кремообразная масса (2са) с пятнами, имеющими цвет от темно-серого до черного (серии близкого к черному цвету - 5
5 дюймов (127 мм), 5 мл), высокая, с мора ини- стой поверхностью, воздушный мицелий от отсутствия до редкого, бесцветный, обратная поверхность кремовая - от палевого до желтого цвета (2са, 2еа) с черными (серии
0 близкого к серому цвету 5 мл) пятнами, растворимый пигмент отсутствует.
Овсяной агар-агар (среда /sp# 3, Дифко) - рост средний, кремообразная масса (2са), средней высоты, гладкая, воздушный
5 мицелий от отсутствия до редкого, бесцвет- . ный, обратная поверхность кремовая - (2са), крем растворимого пигмента (2са).
Неорганические соли - крахмальный агар-агар (среда /sp# 4. Дифко) - рост, плохой, кремообразная масса (2са). тонкая.
гладкая, воздушный мицелий.от отсутствия до редкого, бесцветный, обратная поверхность кремовая - (2са), растворимый пигмент отсутствует.
Глицерино-аспарагиновый агар-агар (среда /sp# 5. Дифко) - рост от плохого до среднего, кремообразная масса (2са), тонкая, гладкая, воздушный мицелий отсутствует, обратная поверхность кремовая - (2са), растворимый пигмент отсутствует.
Сахарозный агар-агар по Чапеку (среда #1, Уоксман, Актиномицеты, т.2 стр.328, 1961) - рост от умеренного до хорошего, кремообразная масса (2са), умеренно высокая, гладкая, воздушный мицелий отсутствует, обратная поверхность кремовая - (2са), растворимый пигмент отсутствует.
Глюкозо-аспарагиновый агар-агар (среда #2, Уоксман, Актиномицеты, т.2 стр. 328, 1961) - рост умеренный, кремообразная масса (2са), от тонкой до умеренно высокой, от гладкой.до морщинистой, воздушный мицелий отсутствует, обратная поверхность кремовая - (2са), растворимый пигмент отсутствует.
Тирозиновый агар по Гордону и Смиту (Гордон и Смит, J. Bacteriol. 69, 147-150, 1955) - рост от умеренного до хорошего, кремообразная масса (2са) от слегка поднятой до.умеренно высокой, от гладкой до морщинистой, воздушный мицелий отсутствует, обратная поверхность кремообразной массы (2са), растворимый пигмент палево- желтый.
Агар-агар с кальциевой солью яблочной кислоты (Уоксман, Bacteriol Rev., 21, 1-29, 1957) - рост незначительный, кремообразная масса (2са), тонкая, гладкая, воздушный мицелий отсутствует, обратная поверхность кремовая (2са), растворимый пигмент отсутствует.
Казеиновый агар-агар (Гордон и Смит, указанная выше статья) - рост хороший, кремообразная масса (2са), высокая, от гладкой до морщинистой, воздушный мицелий отсутствует, обратная поверхность кремовая - палево-желтая (2са), растворимый пигмент желтый (2 да).
Агар-агар по Беннету (Уоксман, указанная выше статья, среда # 30) - рост хороший, кремообразная масса (2са) высокая, от гладкой до морщинистой, воздушный мицелий отсутствует, обратная поверхность кремовая - палево-желтая (2са, 2еа), растворимый пигмент желтый (2еа).
Агар-агар по Эмерсону (указанная выше статья, среда #28, с. 331)- рост умеренный, кремообразная масса палево-желтого цвета (2 са, 2 еа), высокая, морщинистая, воздушный мицелий отсутствует, обратная поверхность кремовая - желтая (2 ic), растворимый пигмент отсутствует.
Питательный агар-агар (указанная выше статья, среда # 14, с. 330) -- рост от
плохого до умеренного, кремообразная масса (2 са) от тонкой до слегка возвышенной, воздушный мицелий отсутствует, обратная поверхность кремовая -(2са), растворимый пигмент отсутствует.
0 Желатиновый агар-агар (Гордон и Мим, J.Bacteriol, 73, 15-27, 1957) - рост хороший, кремообразная масса (2 са), высокая, морщинистая-; воздушный мицелий отсутствует, обратная поверхность кремовая - палево5 желтая (2 са, 2 еа), растворимый пигмент желтого цвета (2 еа).
Крахмальный агар-агар (указанная выше статья) - рост хороший, кремообразная масса (2 са), высокая, морщинистая, воздуш0 ный мицелий отсутстует, обратная поверхность кремовая - палево-желтая (2 са, 2 еа). растворимый пигмент отсутствует,
Картофельно-мррковный агар-агар (Ле- . шевалье, Lab.Clin. Med., 71, 934-944, 1968,
5 но с использованием только 30 г картофеля, . 2,5 г моркови и 20 г агар-агара) - рост от плохого до умеренного, практически белый (почти серые серии 2 Ьа), тонкий, гладкий, воздушный мицелий незначителен или отсутствует, бесцветный, обратная поверх0 ность от бесцветной до кремовой (2 са), растворимый пигмент отсутствует.
Водный агар.-агар (2%) - рост плохой, кр емообразная масса 2 са, тонкий, гладкий, воздушный мицелий отсутствует или незна5 чителен, бесцветный, обратная поверхность кремовая (2 са), растворимый пигмент отсутствует.
Минеральная среда 1 по Гаузе (Гаузе с сотр. Проблемы классификации антагони0 стических актиномицетов англ, издание, с. 13, 1957) - рост от плохого до умеренного, кремообразная масса(2 са), тонкая, гладкая, воздушный мицелий отсутствует или незначителен, обратная поверхность кремовая (2
5 са), растворимый пигмент отсутствует.
Органическая среда 2 по Гаузе (указанный выше источник) - рост хороший, кремообразная масса (2 са), высокая, морщинистая, воздушный мицелий отсутст0 вует, обратная поверхность кремовая - палево-желтая. (2 са, 2 еа), растворимый пигмент отсутствует.„
Морфологические свойства. Морфологические свойства наблюдают 3 недели по5 еле начала инкубирования на питательной среде из неорганических солей - крахмало- вого агар-агара, воздушный мицелий бесцветный, цвет от белого до кремового, цепочки спор прямые, искривленные или
крюкообразные. содержат от 2 до 9 спор на цепочку, споры глобулярные, овальной или эллиптической формы, диаметром 0,8-1,4 мкм или размером 1,1-1,8x0,8-1,2 мкм, гладкие (по данным электронной сканирующей микроскопии). .
Биохимические свойства. Мелатин не продуцируется, сероводород не продуцируется, хселатин разжижается, крахмал не гид- ролизуется, нитрат не восстанавливается до нитрита, не наблюдается ни роста, ни разложения целлюлозной питательной среды по Йенсену или Ливайну и Шенлайну, свертывание и пептонизацмя молока не наблюдается, положительная ферментация казеина, отрицательная ферментация тирозина, отрицательная ферментация соли кальция яблочной кислоты. Использование карбогидратов; используются глюкоза, ара- биноза, фруктоза, маннит, рамноза, сахароза, ксилоза, адонитол, целлобиоза, глицерин, мальтоза, рибоза, крахмал и тре- алоза, не используются инозитол, рафино- за, дульситол , эритритол, галактоза, лактоза, манноза, мелезитоза, мелибрза, альфа-метил-глюкозид, салицин, сорбит и сорбоза.
Прочие положительные результаты тестов включают использование ацетатов и пм- руватов, гидролиз эсулмна и разложение ксантина и гипоксантина. Перечисленные ниже тесты дают отрицательные результаты: на использование бензоатов, цитратов, декстрина, лактатов, солей яблочной кислоты, солей слизневой кислоты, оксалатов, фе- нола, припионатов и сукцин атов, разложение аденина и тирозина и гидролиз гиппурата.
Температурные соотношения
28°С37°С 45°С
ХорошийХороший Хороший
рострост рост
Анализ совокупности клеток.
Гидролизат совокупности клеток содержит мезо-диаминопимеловую кислоту, глюкозу, галактозу, мадурозу, маннозу и рибозу.
Культура N 777-1 характеризуетвя кремовым субстратным мицелием, коротким бесцветным воздушным мицелием, короткими цепочками спор прямой, искривленной или крюкообразной формы и спорами с гладкой поверхностью. Используются глюкоза, арабиноза, фруктоза, маннит, рамоза, сахароза, ксилоза, адонитол, целлобиоза, глицерин, мальтоза, рибоэа, крахмал, тре- лоза, ацетаты и пируваты. Разлагаются ксантин, гипоксантин и эксулин. Анализ
гидролизата совокупности клеток свидетельствует о наличии мезодиаминопимено- вой кислоты и мадуразы. Таким образом, культура N 777-1 принадлежит к роду
Actinomadura в соответствии с данным Г.Ле- шевалье определением.
На основе приведенных выше данных уместно рассматривать культуру N 777-1 в качестве члена рода Actinomadura и припи0 сать ей наименование Actinomadura sp. Данная культура депонирована в Американской коллекции типов Культур под номером АТСС 53708.
Обладающее свойствами антибиотика
5 соединение формулы (I) согласно настоящему изобретению легко продуцируется указанной культурой Actinomadura в результате выращивания последней при температуре в пределах от примерно 24 до
0 примерно 36°С в условиях погружения при перемешивании и аэрации среды, состоя- щей-из источников карбогидратов, таких как сахар, крахмал, глицерин; органических азотсодержащих соединений, таких как со5 еэая.мука, касаминовые кислоты, дрожжевой экстракт; среды для роста, например растворимые зерновые фракции, рыбная мука, мука из семян хлопчатника; минеральных солей, содержащих следовые количест0 ва таких элементов, как железо, кобальт, медь, цинк, и др, и карбоната каль ция или фосфатов в качестве буферных агентов. После завершения выращивания антибиотик может быть легко экстрагирован из пита5 тельного бульона посредством органического растворителя, например н-бутанола, метилизобутилкетона, или хлороформа при рН в диапазоне от 4,0 до 8,0 посредством фильтрования мицелия, который содержит
0 осажденный антибиотик (фильтрат при этом отбрасывают), или в результате непосредственной сушки при распылении или при охлаждении питательного бульона. В альтернативном варианте мицелий или вы5 сушенный бульон в целом экстрагируют одним из перечисленых выше органических растворителей. Затем очищенное соединение, обладающее свойствами антибиотика, при желании выделяют из органического
0 экстракта с использованием стандартных методов концентрированна, соле- или кис- лотообразования, хроматографии, осаждения и/или кристаллизации - в соответствии с приведенными ниже примерами.
5 В соответствии с обычными способами ферментации вначале получают инокулум посредством разрушения растительных клеток, с выращиванием его в подходящей среде, из срезов или сосудов Ру. инокулиро- ванных Actinomadura sp. ATCC 53708. Пол/чаемые при этом растительные клетки в свою очередь используют для инокулирова- ния колб для встряхивания или емкостей для инокулирования, которые также содержат подходящую среду для роста. В альтернативном варианте емкости для инокулирова- ния инокулируют из колб для встряхивания. После соответствующего периода выращивания (обычно от 120,до 144 ч пребывания во встряхиваемых колбах и от 168 до 196 ч пребывания в емкостях для инокулирова- ния), фермент, также содержащий подходящую среду для роста, инокулируют в асептических условиях с растительным питательным бульоном из колб для встряхивания или емкостей для инокулирования. После завершения выращивания (обычно продолжающееся 120-196 ч) антибиотик выделяют по желанию в очищенном или неочищенном виде с использованием того или иного способа из числа перечисленных выше или с использованием специфических способов, описанных ниже в примерах.
Соединение формулы (I) подвергают испытаниям in vitro на наличие бактерицидной активности с использованием стандартных способов, в соответствии с которыми измеряют минимальную ингибиру- ющую концентрацию (МИК) по отношению к одному или нескольким микроорганиз- мам, выраженную в мкг/мл. Подобная методика рекомендована, в частности, в соответствии с результатами совместных международных исследований по чувствительности антибиотиков (Эриксон и Шер- рис, Acta Pathologica et Microbiologia Sqandinav., Supp. 217, Section B, 64-68 (1971), согласно которой используется агар- агаровая мозговая сердечная вытяжка (ВН1) и устройства для реплликации инокула, Пробирки с препаратом, выращиваемым в тече- ние ночи, подвергают 100-кратному разбавлению для использования в качестве стандартного инокулята (от 20000 до 100000 клеток в примерно 20 мл помещают на поверхность агар-агара, 29 мл. агар-агара ВН1/чашку). Для проведения испытания берут примерно двукратные разбавления испытуемого соединения при начальной концентрации испытуемого соединения, равной 200 мкг/мл. При рассмотрении результатов после выдерживания культуры в течение 18 ч при 37°С единичные колонии не принимают во внимание. Способность воздействия на микроорганизм (МИК) для данного испытуемого микроорганизма представляет собой минимальную концентрацию соединения, при которой наблюдается полное ингибирование роста при наблюдении невооруженным глазом. Как и
в случае прочих полициклических простых эфиров. обладающих свойствами антибио- тиков, соединения согласно настоящему изобретению формулы (I) обычно демонст- рируют грамположительную противобакте- рийную активность, а также активность против Treponema hyodysenter iae (агент, вызывающий дизентерию у свиней, о чем свидетельствует материал, приведенный в
0 таблице).
Данные по эффективности соединений формулы (I) и их солей против кокцидозных инфекционных заболеваний цыплят получают согласно описанному ниже способу.
5 Группам по 3-4 цыплят породы белый леггорн возрастом 10 сут дают питание в виде пюре, содержащее равномерно распределенное в нем соединение формулы (I) или его соли натрия и/или калия. После выдержива0 ния птиц на указанном рационе в течение 24 ч каждому из цыплят инокулируют через рот оциты конкретных видов испытуемых микроорганизмов рода Eimeria. Другим группам из 3-5 цыплят в возрасте 10 сут
5 дают аналогичную пищу в виде пюре, не содержащую соединений формулы (I) или их солей. Их также инфицируют спустя 24 ч, эти птицы служат в качестве контрольной зараженной группы. Еще одной группе из 3-5
0 цыплят в возрасте 10 суток дают аналогичную пищу в виде пюре без антибиотиков, и птиц не подвергают заражению кокцидо- зом. Эта группа служит в качестве контрольной по нормальным условиям. Результаты
5 проведённой обработки оценивают спустя 5 сут в случае заражения E.acervulina и спустя 6 су.т для прочих видов.
. Критерий, используемый для измерения противококцидозной активности, соответ0 ствует оценке поражения по шкале от 0 до 4 для E.tenella по способу Дж.Э.Линча, Новый способ первичной оценки противококцидозной активности, Am. J. Vet. Res. 22, 324- 326, 1961, по шкале от 0 до 3 для всех
5 остальных видов в соответствии с методикой оценки, разработанной Дж.Джонсоном и У.Г.Рейдом, Методика определения снижения степени поражения при использовании противококцидозных средств при
0 проведении экспериментов на цыплятах в клетках, Ext. Parasit, 28, 30-36, 1970.
Активность определяют посредством деления оценки поражения для каждой из групп, прошедших обработку, на аналогич5 ную оценку поражения для инфицированной контрольной группы. В соответствии с указанным испытанием соединение формулы (I) и его катионные соли обладают отличной активностью по отношению к разновидностям Eimeria tenella. Eimeria
acervullna, Elmeria maxima, Eimeria drunettl, Elmerla necatrix при заражении домашней птицы в случае, когда их вводят в пюреоб- разную пищу для цыплят в количестве примерно от 0,1 до примерно 25 м.д. Так, например, по отношению к чувствительной разновидности Eimeria tenella соединения формулы (I) проявляют 100% контроля поражения при столь малых дозах, как, например, 5 м.д.
Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами. Следует однако понимать, что изобретение не ограничивается конкретными деталями указанных примеров.
Пример 1. Ферментация Actinomadura sp. ATCC 53708. Выделение соединения формулы (I) в виде его соли натрия.
Микроорганизм Actinomadura вначале выращивают в результате инокулирования твердой среды на срезах или в емкости Ру
С
г/л
Церелоза10 Соевая мука 10 Твердая ферментационная фракций кукурузы 5 Кукурузный крахмал 10
Хлорид натрия Хлорид кобальта Хлорид кальция
100 мл среды помещают в колбу для встряхивания на 300 мл и стериализуют при 120°С и давлении 15 фунт/кв.дюйм (примерно 0,1 кг/кв.см) в течение 30 мин. После охлаждения среду инокулируют суспензией растительных клеток, полученную из срезов указанной выше культуры Actinomadura. Колбы встряхивают при 28°С на устройстве, имеющем амплитуду от 1,5 до 2,5 дюймов (от 37 до 64 мм) и скорость вращения 150-200 об/мин в течение 5-7 сут.
Одновременно получают в 5-литровых емкостях по 3 л одной из указанных выше сред С или IDY ТТ или указанной ниже среды: UKI-2г/л Церелоза 45 Соевая мука 10 Жидкая фракция
варки кукурузы10 Хлорид кобальта 0,002 Сульфат магния 0,10 Карбонат кальцит 3 Сульфат марганца 0,10 Сульфат двухва- лентного железа 0,10
культурой АТСС 53708 с использованием среды N 172 по нормам АТСС, получение и нормы расхода приведены ниже (в г/л). Глюкоза10
Растворимый крахмал 20 Дрожжевой экс- тракт 5 Ферментативный
гидролизат казеина1 Карбонат кальция 1 Дистиллированная вода до 1000 мл, рН доводят до 7,0
посредством КОН, добавляют агар-агар 30
Среду в колбах для встряхивания получают в соответствии с любым из приведен- ных ниже составов:
К среде добавляют 1 мл средства против
IDYTT
г/л
Церелоза-10 Кукурузный крахмал 5 Жидкая фракция варки кукурузы 5 Ферментативный гидролизат казеина 5
Хлорид кобальта Карбонат кальция
0,002
3
образования пены (полипропиленгликоль 32000, содержащий 10 мас.% окиси этилена), емкости закрывают и стерилизуют при 120°С и давлении 15 фунт/кв. дюйм в течение 45 мин. Затем среду в емкостях инокулируют содержимым одной колбы для встряхивания (примерно 3% инокулума), ферментируют втечение 120-168 ч при 30°С, перемешивают при скорости 1700 об/мин при количестве воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в минуту.
После завершения ферментации (по данным антибиотического теста против B.Subtilis АТСС 6633) ферментационные устройства останавливают и фильтруют их содержимое через диатомитовую землю при имеющемся рН. Осадок на фильтре переводят во взвесь в метаноле, концентрируют в вакууме, разбавляют 2-3 объемами воды и экстрагируют дважды порциями от 1/3 до 1/2 объемами либо метилизобутилкетона, либо н-бутанола. Слой растворителя отделяют от водной фазы посредством отсасывания или центрифугирования, взбалтываюти концентрируют в вакууме, получая антибиотик формулы (I) в неочищенной форме в виде вязкого масла.
Биологическую активность питательного бульона и последующих выделенных фракций можно исследовать с использованием чувствительных штаммов Bacillus subtllls ATCC 6633 или Staphylococcus aureus ATCC 6538. Компоненты питательного бульона и выделенных фракций могут быть визуализированы с использованием пластинок с силикагелем CF Анальтек и этилацетата в качестве элюента. Проявленные пластины опрыскивают ванилиновым реагентом (3 г ванилина в 75 мл этзнола и 25 мл 85%-ной фосфорной кислоты) и нагревают до 80°С. Обладающий свойствами антибиотика продукт формулы (I) проявляется в виде пурпурного пятна. Проявленные пластины для тонкослойной хроматографии могут быть также покрыты агар-агаром, в который помещены культуры Bacillus subtllis или Staphylococcus aureus, к которым добавляют 2,3,5-трифенил-2Н-тетразо- лилхлорида (моногидрат), и инкубируют при 37°С в течение 16 ч для визуализации антибиотика (белые пятна на розоватом фоне).
Крупномасштабный эксперимент в больших емкостях для ферментации осуществляют посредством получения продукта в колбах для встряхивания, содержащих 0,7л среды С1 или-IDY ТТ. Инокулум из указанных колб ферментируют в течение 5-7°сут при 28°С и используют полученный иноку- лум для инокулирования емкостей для фер- ментации объемом 200 или 6000 л, содержащих 100 или 4000 л среды UKI-2 соответственно. Примерно 1 л инокулума используют для инокуляции каждой емкости. После ферментации в течение 7-10 сут получают готовый продукт.
Весь питательный бульон в меньших по размеру ферментаторах экстрагируют 50 л метилизобутилкетона при имеющемся рН, Органический экстракт концентрируют в вакууме в циклон-аппарате и вакуумном испарителе с получением масла. 1у1асло затем дважды хроматографируют на колонке с силикагелем (гексан). В первой колонке элюи- рование осуществляют этилацетатом, а во второй - смесью 1:1 хлороформ - ацетон. Фракции, содержащие продукт, идентифицируют тонкослойной хроматографией с использованием описанного выше способа. Активные фракции после второй колонки с силикагелем вновь хроматографируют на флорисиле, используя для элюирования смесь хлороформа и метанола 19:1. Фракции, содержащие продукт, объединяют, встряхивают с разбавленной фосфорной
кислотой, затем с двухосновным фосфатным буфером для получения соли натрия, сушат над сульфатом натрия, разгоняют и кристаллизуют остаток из эфира, получая в
результате соль натрия соединения формулы (I) в количестве 915 кг, температура плавления 245-2490С,.(альфа),0 (, метанол).
Результаты анализа из расчета на
C45H 70idNa.
Рассчитано. %: С 62,47; Н 8,97, Найдено, %: С 62,89; Н 9,22. Спектр ЯМР-С-13 (хим. сдвиги в м.д, в дейтерохлороформе с указанием числа
атомов водорода данного типа): 182,8-ОН. 110,0-ОН, 106,0-ОН; 99,1-IH; 87.2-1H; 86,9- ОН; 86,2-1 Н; 86,2-ОН; 84,8-1 Н; 83,4-ЧЖ; 82,6-1 Н; 80,2-1 Н; 78,6-1 Н; 75,2-1 Н; 74,8-1 Н; 74,6-1 Н; 66,4-1 Н; 60,3-ЗН; 57,9-ЗН; 56,9-ЗН;
44,5-1 Н; 39,0-1 Н; 36,9-1 Н; 36,8-2Н; 25.9-2Н;
25,0-ЗН; 21,0-ЗН; 18,3-ЗН; 16,7-ЗН; 15,3-ЗН;
13,4-ЗН; 13,1-ЗН; 11.2-2Н; 10,7-ЗН; 10,6-ЗН.
Работа с использованием больших фер- ментизационных емкостей проводится с экстрагированием всего питательного бульона (примерно 4000 л) 1800 л метилизобутилкетона, отделением растворителя в экстракторе Подбельняка и концентрирова- нием в вакууме с удалением растворителя и получением сиропообразной массы. Концентрат дважды растирают с равным объемом неразбавленного метанола, отделяют нерастворимое в метаноле масло, а мета- нольную фракцию концентрируют в вакууме с -получением сиропообразной массы. Указанную массу дважды экстрагируют гексаном, а объединенные экстракты в гексане - ацетонитрилом. Ацетонитрильную фракцию сохраняют для дальнейшего извлечения продукта. Гексан концентрируют в вакууме и хроматографируют на колонке с силикагелем по частям. Продукт десорбируют из си- ликагеля на воронку с фильтром вначале гексаном, затем хлористым метиленом, этилацетатом, и наконец ацетоном, Активные фракции, которые содержатся, в элюатах в
хлористом метилене и этилацетате, растворяют в гексане и промывают подкисленной водой, после чего экстрагируют 1%-ным раствором N-метил-О-глюкамина в воде. Водную фазу подсаливают хлоридом натрия
и экстрагируют 2 равными по объему порциями этилацетата. Органические слои объединяют, обрабатывают активированным углем, фильтруют, промывают фосфатным буфером с рН 9,0, сушат над сульфатом натрия, кон центрируют в вакууме и кристаллизуют из эфира, получая 50,8 г соли натрия, идентичной с продуктом, полученным в результате менее масштабной ферментации.
Пример 2. Соединение формулы (I) в форме свободной кислоты.
Соединение формулы (I), Обладающее свойствами антибиотика в форме свободной кислоты, получают в результате интен-- сивного встряхивания в делительной коронке раствора соли натрия в хлороформе с равными объемами соляной кислоты при рН 2. Фазы разделяют, промывают фазу хлороформа водой и разгоняют в вакууме, получая свободную кислоту, имеющую тем- пературу плавления 87-90°С (альфа) 6,9°С(, метанол).
Результаты анализа из расчета на 0,5 НаО.
Рассчитано, %: С 63,48; Н 9,34.
Найдено, %: С 63,35; Н 9,53.
Пример 3. Соединение формулы (I) (соль натрия).
Свободную кислоту, полученную в предшествующем примере (45 мг), растворяют в 100 мл хлороформа. К раствору добавляют раствор карбоната натрия (0,5 г) в воде (100 мл) и Помещают полученную смесь в делительную воронку, после чего интенсивно встряхивают в течение нескольких минут. Слой в хлороформе разделяют, а водный слой промывают свежим хлороформом. Объединенные экстракты в хлороформе сушат над сульфатом натрия, фильтруют и разгоняют в вакууме, получая 41 мг соли натрия, температура плавления 230-235°С.
Результаты анализа из расчета на
C45H770l/jNa. .
Рассчитано, %: С 62,47, Н 8,97.
Найдено, %: С 62,20; Н 9,14.
хОМе Me
заключающийся в том, что осуществляют глубинное культивирование штамма Actinomaclura sp. ATCC 53708 в условиях аэрации и перемешивания в питательной среде, содержащей источкики углерода, азота и минеральные соли, с последующей
Пример 4. Соединение формулы (I) (соль рубидия).
Для получения соли рубидия соединения формулы (I) 30 мг свободной кислоты растворяют в 50 мл хлороформа. К раствору в хлороформе добавляют раствор 35 мг карбоната рубидия в 251ил воды и перемешивают полученную смесь в течение 2 ч. Органическую фазу отделяют и экстрагируют водный слой равным объемом хлороформа. Объединенные экстракты в хлороформе разгоняют, получая твердый белый остаток. Соль рубидия перекристаллизовывают в результате медленного испарения из эфира и определяют структуру полученных кристаллов методом рентгеноструктурного анализа (д-р Дж. Бординер).;
Пример 5; Соединение формулы (I) (соль калия).
Для получения соли калия соединения формулы (I) 130 мг свободной кислоты растворяют в 100 мл хлороформа. К раствору в хлороформе добавляют раствор 100 мг карбоната калия в 100 мл воды и перемешивают полученную смесь в течение нескольких минут, после чего помещают ее в делительную воронку и интенсивно встряхивают в течение нескольких минут. Органическую фазу отделяют и разгрняют в вакууме, получая соединение формулы (I) в виде белого порошка, температура 255-260°С, (аль- фа),6° (, хлороформ).
Результаты анализа из расчета на
С45Н77Р14К.
Рассчитано, %: С 61,34, Н 8,81. Найдено, %: С 60,91, Н 8,83.
Формул а изобретения
Способ получения антибиотика формуэкстракцией органическим растворителем всей культуральной жидкости или отфильтрованного мицелия и выделением целевого продукта, который при необходимости переводят в фармацевтически приемлемую щелочно-металлическую соль.
Исследования in vitro антибактериальной активности соединения формулы (I)
Редактор Л.Волкова
Техред М.Моргентал
Заказ 1394Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Корректор П.Гереши
| Аналогов в научно-технической и патентной литературе не выявлено |
