Способ получения иммуногена, стимулирующего иммунную систему человека, зараженного HIY Советский патент 1993 года по МПК A61K39/12 

Изобретение относится к борьбе с ре- ровирусами, более конкретно к способу юлучения иммуногена, стимулирующего иммунную систему человека, зараженного HIV.

Цель изобретения - создание высоко- ффективного средства для борьбы с ретро- ирусами, преимущественно ретровирусом HIV.

Поставленная задача решается предла- аемым способом получения стимулирующего иммунную систему человека, араженного HIV, заключающимся в том, то зараженные HIV клетки выращивают в редеЯРМ 1640 в присутствии эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 5- -супернатант фильтруют, к фильтрату добавляют/3-пропиолактон и инкубируют в ечение 5 часов при 37°С и рН среды 7,2-7,4, юсле чего замораживают, облучают гамма-лучами, размораживают, концентриру-. ют, пропускают через миллипоровые пол- исульфоновые фильтры, очищают вначале центрифугированием с 30%-ной сахарозой, затем центрифугированием з градиенте 30- 45%-ной сахарозы, а це.эвой продукт получают ресуспендированием полученного осадка в PBS буфере при концентрации 1 мл на 10 л исходного вещества.

На фиг. 1 представлена схематическая модель HIV.

Как показано на фиг.2, геном РНК HIV кодирует три основных структурных гена: gag, pol и env, которые фланкированы на обоих концах длинными концевыми дупликациями (LTR). Ген gag кодирует специфические белки ядра, р55, р39, р24, р17 и р15. Гены pol кодируют обратную транскриптазу р65/р51 и протеазу р31. Гены env кодируют гликопротеин наружной мембраны др 120 и

оо

Сл)

VJ со о

О

со

его предшественник gp 160, а также трансмембранный гликопротеин др41. Некоторые из генов являются чрезвычайно вариабельными, в частности, гены env.

Кроме того, существуют пять других генов, не присутствующих в других ретрови- русах, которые либо вовлечены в транскрипционную или трансляционную регуляцию, либо кодируют другие структурные белки. Структура гена HIV известна. Она описана Ратнером и др. Nature, 313, стр.277 (1985).

HIV присоединяется к клеткам хозяина путем взаимодействия мембранных гликоп- ротеинов с поверхностным рецептором клетки. Оказывается, что при контакте HIV с клеткой Т4 протеин др120 взаимодействует с рецептором CD4. Вирусная оболочка затем слияется с клеточной мембраной, и внутреннее ядро вируса входит в зараженную клетку, где транскрипция РНК в вирус ДНК катализируется обратной транскрипта- зой. Провирус может оставаться в клетке в латентной форме в течение нескольких месяцев или лет. и все это время зараженный индивидуум является бессимптомным. Однако, если вирус позднее активируется, вызывая вирусную репликацию и иммуносупрессию, индивидуум будет затем восприимчив к условно-патогенным заражениям, включая рак, ассоциируемым со спидом.

На фиг. 3 представлено схематическое воспроизведение уровня некоторых антител и антигенов, присутствующих в развитии из бессимптомного состояния до состояния ARC (связанный со спидом комплекс) и до сгмда у HIV - сероположительных пациентов, зараженных HIV.

Результаты анализа по Вестерну имму- ногена по примеру 1 показывают, что он свободен от белков наружной оболочки при скрининге гомологичными и гетерологичны- ми сыворотками, которые содержат высокие титры антитела против белков наружной оболочки.

Как показано схематически на фиг.З, высокие уровни антитела против gp 160/120 (наружная оболочка), которые присутствуют в бессимптомной фазе заражения HIV, также продолжают существовать в симптомной фазе. Уровень антитела р24 в бессимптомной фазе является высоким, но, по-видимому, снижается в симптомной фазе. Аналогично, HIV - сероположительные сыворотки содержат антитело, которое инги- бирует функцию обратной транскриптазы. У пациентов, в которых антитело против обратной транскриптазы присутствует на высоких уровнях, попытки относительно

0

5

выделения вируса менее часто положительны, нежели у тех, в которых оно отсутствует. Поэтому следует, что уменьшение клеточных и гуморальных иммунозащитных факто- ров, таких, как Т4-клетки и антитела против GAG, включая анти-р24, и антитела против pol, включая антитело против обратной транскриптазы, связано с развитием спида.

Используемый термин HIV включает типы 1 и 2 и является синонимом HTLV-III, LAV-1 и LAV-2. HIV относится к вирусу в общем смысле и включает все формы, подтипы и вариации.

Используемый термин белок наружной оболочки относится к той части мембранного гликопротеина ретровируса, которая выступает за пределы мембраны, в противоположность трансмембранному белку, др41. Белок наружной оболочки HIV является синонимом др120 и его предшественника др160.

Используемый термин др120 или др160/120 относится к гликопротеинам, имеющим либо антигенную специфичность, либо биологическую функцию белка наружной оболочки; др160, как полагают, является предшественником др120.

Используемый термин генный продукт относится к полипептиду или белку, который кодируется геном. Термин, как предполагают, включает в себя белковые производные, такие, как гликопротеины. Понятно, что в аминокислотную последовательность генного продукта могут быть внесены ограниченные модификации без нарушения биологической функции или им- муногенности генного продукта, и только часть первичной последовательности может потребоваться для иммуногенности.

Идентификация HIV - специфических генов и генных продуктов основана на терминологии HIV типа 1, представленной на фиг.1. Предполагается, однако, что ссылка на специфический ген или генный продукт HIVTwna 1, на основе его молекулярной массы, будет также включать соответствующий ,ген или генный продукт H1V . типа 2 и, когда присутствует гомологичный ген, другие ре- тровирусы. Генные продукты других типов и родов могут иметь незначительно отличающиеся молекулярные массы. Например. gp41 H1V типа 1 эквивалентен дрЗб типа 2, тогда как д р120 типа 1 соответствует др130 типа 2.

HIV можно культивировать из пробы периферической крови зараженных индивидуумов. Например, одноядерные клетки из периферической крови, такие, как лимфоциту, могут быть получены путем наслоения

5

0

5

5

5

п эобы гепаринизированной венозной кро- в 1 по градиенту плотности Ficoll-Hypaque и центрифугирования пробы. Одноядерные .клетки затем собирают, активируют, например, фитогемагглютинином, в течение двух- т ех дней и культивируют в подходящей сэеде, предпочтительно пополненной ин- Т флейкином 2. Вирус может быть обнару- жен либо анализом на обратную т эанскриптазу, анализом с захватом антигена для р24, иммунофлюоресценцией, либо Э1ектронной микроскопией для обнаружения присутствия вирусных частиц в клетках. Е се эти методы хорошо известны специалистам в Данной области. После выделения в/ipyc может быть включен в другие клетки.

Важно использовать неинфекционную вакцину с тем, чтобы избежать проникновения инфекции в хозяина. Различные методы хорошо известны для придания болезнетворному организму неинфекционности. Е ирус можно инактивировать или сделать реп лика ционно-недоетаточным. Предпочтительно, однако, обрабатывать его комби- нацией бета-пропиолактона и гамма-излучения. При этом /3-пропиолак- тэн должен находиться в контакте с вирусом, как минимум, 2,5 часа. С тем, чтобы голностью удалить какой-либо остаточный Јета-пропиолактон, бета-пропиолактон р олжен оставаться в растворе в течение, как N инимум, пяти часов при температуре 37°С.

Выделенный .вирус затем обрабатывают так, чтобы удалить белки наружной оболочки. Такое удаление предпочтительно осуществляют неоднократными замораживанием и оттаиванием вируса в сочетании с физическими методами, которые вызывают набухание и сокращение вирусных частиц, хотя также можно использовать другие фи- г ические и нефизические методы, такие, как f азрушение ультразвуком, в отдельности i ли в сочетании друг с другом.

Для иммунизации человека или животного получаемый предлагаемым способом t ммуноген применяется вместе со вспомогательными веществами. Но он можеттакже г рименяться в своей водной форме без Еспомогательного вещества. При этом дозу Е ыбирают так, чтобы она была иммунологи- 1ески эффективной, и она, как правило, со- ставляет от 1 до 100 мкг белка, г редпочтительно, около 30 мкг белка.

Активную иммунизацию осуществляют ti, предпочтительно, повторяют раз с минимальным интервалом, по меньшей мере, 90 /,ней, хотя дополнительные ревакцинации Могут подходить в соответствии с изменени- J ми в уровне иммунной активности на осно- i е, например, уменьшения количества

антител против HIV-генным продуктам, другим, нежели белки наружной оболочки. Такую иммунизацию предпочтительно осуществляют первоначально путем внутри- 5 мышечной инъекции с последующей внутри- кожной инъекцией, хотя может быть использована любая комбинация внутри- кожной и внутримышечной инъекции.

Предпочтительно иммунокомпетент10 ность или иммунную активность серополо- жительного индивидуума определяют перед иммунизацией с тем, чтобы определить подходящий путь лечения. В качестве метода такого определения сыворотки пациентов

15 подвергают скринингу на присутствие антител против р24 (например, при помощи им- муноферментного твердофазного анализа), антитела против обратной транскриптазы и/или уровня клеток Т4 при помощи хорошо

0 известных методов. Пациенты, проявляющие индикаторы низкой иммунокомпентент- ности, например, низкие титры р24 или антитела против обратной транскриптазы или низкие количества клеток Т4, являются

5 подходящими кандидатами для пассивной иммунотерапии, предпочтительно в сочетании (проводимой перед или совместно) с активной иммунизацией.

Серонегативные индивидуумы могут

0 быть вакцинированы с тем, чтобы вызвать иммунозащитные факторы для предотвращения инфекции. Предпочтительно, вакцину вводят первоначально путем внутримышечной инъекции с последующим

5 введением бустера, осуществляемым либо внутримышечно, либо внутрикожно. Физиологически эффективная доза содержит предпочтительно от 1 до 100 мкг, и более предпочтительно, около 30 мкг иммуногена.

0 Вакцину предпочтительно вводят в сочетание с адъювантом, т.е. вспомогательным веществом, наиболее предпочтительно, адъювантом для обеспечения получения препарата типа вода .в масле. Различные

5 подходящие адъюванты хорошо известны в данной области.

Кроме того, поскольку антитела против др160/120 могут содействовать вирусной абсорбции клетками, эти специфические ан0 титела могут быть удалены из пациента, зараженного HIV, перед иммунотерапией. Иммуносорбентные колонки, выполненные из полых целлюлозных волокон, модифицируют с тем, чтобы ковалентно связать лиган5 ды, реакционноспособные с антителами противдр160/120.Такие лиганды включают антигены др160/120, полученные из очищенных гликопротеинов, которые в свою очередь получены из только что собранных вирусных частиц или из культурального супернатанта Н У-продуцирующихТ4-лимфоцитов, Альтернативно, такие лиганды могут быть получены методами рекомбинантной ДНК с использованием трансфецированных клеток. Альтернативно, идиотипы, рекцион- носпособные с антителами против др160/120, могут быть использованы для этих целей..

Такие анти-идиотипные антитела могут быть получены методами, хорошо известными в данной области.

Пример 1. Получение вирусных частиц, свободных от белков наружной оболочки.

Клетки, зараженные штаммом HIV No Hz 321 (выделившимся из плазмы 26-летней африканской женщины из Сайра), выращивают в среде А, состоящей из RPMI 1640 с 10%-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 25 мМ буфера HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и 100 мгк/мл стрептомицина.

Культуры увеличивают в объеме путем подачи исходных клеток в центрифужные пробирки и доведения объема приблизительно до 8 л добавкой предварительно нагретой среды А. При этом степень разведения составляет приблизительно 1:5. Затем осуществляют второе разведение в соотношении 1:3. Супернатант от 5-7-дневной суспензии HIV-зараженных клеток фильтруют через фильтр размером 0,45 мкм. Свежеприготовленный раствор 1:40 бета- пропиолактона прибавляют к супернатанту до конечной концентрации 1:4000. Раствор инкубируют в течение пяти часов при температуре 37° С и рН поддерживают на уровне 7,2-7,4.

Через 5 ч 20 мл раствора супернатанта удаляют с тем, чтобы определить уровень инфективности и количество оставшегося бета-пропиолактона. Затем супернатант замораживают при температуре -70 С. Замороженный супернатант затем подвергают гамма-облучению кобальтом 60 мощностью 4,5 MR.

Раствор супернатанта затем оттаивают и концентрируют путем 40-кратной фильтрации через выполненные с молярной массой 100000 фильтры. Концентрат подают в снабженные мешалкой колбы Т-21, предварительно обработанные 70%-ным изопро- панолом, и центрифугируют при 28000 об/мин.в течение одного часа. Супернатант удаляют и осадок повторно суспендируют в содержащем ЭТУК натриевом буфере до общего конечного объема приблизительно 24 мл. 4 мл этой суспензии расслаивают над 8 мл 30%-ной сахарозы в полиалломерных пробирках, предварительно обработанных

70%-ным изопропанолом, и центрифугируют в течение одного часа при 28000 об/мин. Супернатант сливают из 30%-ной сахарозы и осадок ресуспендируют в указанном натриевом буфере.

Градиент в ультрасветлых центрифужных пробирках, предварительно обработанных 7Ь%-ным изопропанолом, устанавливают путем прибавления 3 мл

0 45%-й сахарозы в пробирку и наложения сверху 6 мл 30%-й сахарозы. 3 мл вышеописанной суспензии наслаивают на раствор. Пробирки центрифугируют в течение 60 мин при 28000 об/мин.

5 Раствор над слоями при 35%-ном переходе отсасывают пипеткой и сливают. Слои из всех пробирок соединяют в одной конической пробирке и разбавляют в соотношении 1:10 фосфатсодержащим буферным

0 солевым раствором. Растеор центрифугируют в полиалломерных пробирках, предварительно обработанных 70%-ным изопропанолом, в течение одного часа при 28000 об/мин. Супернатант удаляют и осад5 ки в пробирках ресуспендируют в указанном фосфатсодержащим буферном растворе при концентрации 1 мл на 10 л исходного вещества.

Альтернативно, особенно, когда имму0 ноген получают в больших количествах, стадию облучения можно осуществлять после объединения слоев. Затем вирус расслаивают на градиенте 15-50%-ной сахарозы. Вирусные слои объединяют и ресуспендируют

5 в вышеуказанном фосфатсодержащем буферном растворе. Вирус центрифугируют при 28000 об/мин в течение одного часа и ресуспендируют в упомянутом буферном растворе до конечной концентрации, рав0 ной 1,0 мг/мл.

Количество имеющегося белка определяют в соответствии с методом Бредфорда (см.Апа. Blochem., 72, с.248, 1976). Белок разбавляют вышеуказанным фосфатсодер5 жащим буферным раствором до концентрации, равной 1,0 мг/мл,

Уровень остаточного бета-пропиолактона в иммуногене определяют с использованием капиллярного газо-жидкостного

0 хроматографа. При этом приготовляют стандартные растворы бета-пропиолактона и масляной кислоты, имеющие концентрации между 141,500 частями на миллион. Пробы объемом 2 мкм вводят в капиллярный хро5 матограф в соответствии с рекомендацией изготовителя. Предел обнаружения составляет 0,1 ч/мл. Иммуноген содержит менее, чем 0,05 ч/мл, бета-пропиолактона.

Восемь проб иммуногена анализируют на содержание бета-пропиопэктона капилрной газовой хроматографией, используя

м сляную кислоту в качестве внутреннего андарта. Используют следующие хрома- графические условия: колонка: 30 м х 0,25

м|л, кварцевое стекло, открытая, трубчатая; ационарная фаза: 100%-ный цианопро- 1л-кремний; температура ввода пробы

1 0°С; рабочая температура: 70°С/1мин, °С/мин до 130°С; методика ввода пробы: расщепляющая. При вышеприведенных ловиях время удерживания бета-пропио- ктона и масляной кислоты соответствует 52 мин и 6,70 мин, соответственно. Ввод 2

мКл 1 ч/мл, раствора бета-пропиолактона иводит к получению пика, который может 1ть измерен количественно. Концентра- /1я 1 ч/мл раствора до 1/10 его объема ариванием растворителя при температу- 40°С при пониженном давлений не прив эдит

ощутимой

потери

та-пропиолактона. Предел обнаружен по- е концентрации составляет 0,1 ч/мл./0,1 м|кг/мл. С тем. чтобы подтвердить то, что омуноген свободен от белков наружной олочки, иммуноген вначале разделяют на 1 ,0%-ных полиакриламидных гелях с применением додецил сульфата натрия в соот- тствии со способом Лэммли, см.Nature 7, стр. 680, 1970). Очищенный материал тем переносят на нитроцеллюлозную бу- Магу в соответствии с методом, предложенным Таубином и др. (см.Ргос, Nature. Acad, :i., 76, стр. 4350, 1979) и иммуноокрашива- кЈт в соответствии с методом, предложен- )М Цанг м др. (cM.Meth. Enzymalogy, 92, p. 377, 1983 г.). Пятна полученного таким разом иммуногёна не имеют полосу, соот- тствующую др 120/160, как указано в контрольных испытаниях, при взаимодействии с сыворотками, содержащими высокие титры анти-др160/120.

Коммерческие полоски с имеющимися а них белках HIV, подвергнутые скринингу с гетерологичной сывороткой (шимпанзе / 86-С и А-3), и содержащие высокие титры гнтит ел против белков наружной оболочки, с р160/120, являются негативными (нереак- 1,ионноспособными) на полосках, получен- I- ых при анализе полученного Е ышеописанным образом иммуногёна, сво- { одного от наружной оболочки. Гомологиче- ские человеческие сыворотки (003 и 010), содержащие высоко-титры антител против (юлков наружной оболочки, др160/120, яв- /яются реакционно-способными с коммер- ескими полосками, но негативными с полосками, полученными из иммуногена, свободного от наружной оболочки. Как гомологические, так и гетерологические сыворотки вступают во взаимодействие с

другими генными продуктами НIV. Отсутст вне белков наружной оболочки на предлага емом иммуногене подтверждают электронной микроскопией. К иммуноген ному препарату последовательно добавляют 2,5%-ный глутаральдегид и осмиевый ангидрид, дегидратируют с помощью растворов этанола разных концентраций и заливают в EPON-812. Тонкие шлифы

0 получают с помощью прибора LKB Ml crotome (фирма LKB, Уписала, Швеция) с использованием алмазного скальпеля. Толщина шлифов составляет 60 нм. Шлифы ок- рашиваютуранилацетатоми

5 лимоннокислым свинцом, наблюдают и фотографируют с использованием электронного микроскопа марки Цейс 109. Служащие в качестве контроля клетки, зараженные HIV, подготовляют с использованием той же ме0 тодики. При этом обнаруживают, что иммуноген не имеет темно-окрашенную наружную оболочку, которая присуща контрольным пробам и которая отражает др160/120 на вирусной поверхности.

5 Пример 2. Иммунотерапия серополо- жительных индивидуумов. Девять пациентов, сероположительных к HIV, лечат иммунотерапией при даче иммуногена по примеру 1. При этом иммуноген эмульгиру0 ют в соотношении 1:1 в неполном адъюван- те Фройнда в эмульсификатрре марки Spex 8000 Mixer Mill инофирмы Спекс Индастриз Инк., США. 1,0 мл раствора, содержащего 100 мкг белка, вводят внутримышечно. Бус5 тер 100 мкг белка без адьюванта вводят через 90 дней путем внутрикожной инъекции.

Присутствие вируса HIV в лимфоцитах периферической крови пациентов опреде0 ляют как до, так и после иммунизации путем сокультивирования вместе со свежеприготовленными лимфоцитами периферической крови, стимулированными фитогемагглюти- ном и интерлейкином-2 в соответствии с

5 методом Галло и др. (cM.J.CIIn. Microb., 25, с. 1291,1987). Оборудование для обнаружения присутствия антигенов HIV, таких, как р24, коммерчески доступно (например, от инофирмы Е.И.Дю-Пон энд Де-Немурс Ко., Инк,

0 США). Каждого пациента обследуют три раза перед иммунизацией и через 2,4,6.8,12 и 14.недель после иммунизации.

В таблице представлены результаты исследований. Пациенты 010 и 003, из которых

5 HIV выделен перед иммунизацией, не проявляют выделяемый вирус вплоть до 12 недели после иммунизации. Пациенты 008 и 009 не являются переносчиками вируса вплоть до 8 недели после иммунизации. Все четыре этих пациента проявляют высокие

титры анти-р24 ( 1:5000) и антитела против обратной транскриптазы ( 1:1000) перед иммунизацией. Остальные пять пациентов, которые проявляют низкие титры анти-р24 и антитела против обратной транскриптазы перед иммунизацией, продолжают проявлять выделяемый вирус после иммунизации.

Формула изобретения Способ получения иммуногенэ, стимулирующего иммунную систему человека, зараженного HIV, заключающийся в том, что зараженные HIV клетки выращивают в среде RPMI 1640 в присутствии эмбриональной

5

сыворотки крупного рогатого скота, 5-7- дневный супернатант фильтруют, к фильтрату добавляют / -пропиолактон и инкубируют в течение 5 ч при 37°С и рН среды 7,2-7,4, после чего замораживают, облучают у-лучами, размораживают, концентрируют, пропуская через миллипоро- вые полисульфоновые фильтры, вначале центрифугированием с 30%-ной сахарозой, затем центрифугированием в градиенте 30- 45%-ной сахарозы, а целевой продукт получают ресуспендированием полученного осадка в PBS буфере при концентрации 1 мл на 10 л исходного вещества.

Область использования: вирусология. Сущность изобретения: предлагается неин- оекционный иммуноген, содержащий ре- ровирусные частицы, лишенные белков наружной оболочки, или содержащий выбранные антигены, выделенные из ретрови- руса. Также предлагается вакцина, эффективная против HIV. В одном варианте осуществления изобретения иммуноген пригоден для иммунизации индивидуума, ранее зараженного ретровирусом, включая HIV. с тем. чтобы индуцировать иммуноза- щитные факторы, защитные против развития заражения. Иммуноген может также использоваться для получения антител для пассивной иммунотерапии как таковой или в сочетании с активной иммунотерапией, у индивидуумов, зараженьых ретровирусом, включая HIV, предпочтительно тех индивидуумов, которые проявляют низкие уровни антител к продуктам ретровирусного гена иным, нежели наружная оболочка. 3 ил., 1 табл. (Л С

IjAHmreno против обратной транскр.иптаэы 2} Нейтрализующее антитело

Мембрана UPID

др120

дР41

Белки ядра

оо со -д оэ со о

Белки наружной оболочки

|

о

«j

се. t

и

и

ш to

diuj.