Способ обнаружения антител к ВИЧ-2 Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 A61K39/12 

Ё

Использование: вирусология. Сущность изобретения: получают антигенный пептид формулы X-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser- Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg- Gln-Val-Cys-Hls- Thr-Thr-Va.l-Pro-Trp-Val-Asn-Y-Z, соответствующий области глюкопротеида gp41, кодированной геном оболочки ВИЧ-2. Пептид является иммунологически реакци- онноспособным со специфическими антителами ВИЧ-2 и используется для обнаружения заражения ВИЧ-2 или его воздействия и в композициях для стимулирования получения антител против ВИЧ-2 у животных и человека. 1 табл.

Изобретение относится к синтетическому пептидному- антигену, последовательность которого соответствует фрагменту иммунологически важного протеина вируса ВИЧ-2. Этот пептид полезен как диагностик для определения присутствия антител к вирусу ВИЧ-2. Этот пептид может быть также полезен как иммуноген в композициях, служащих для определения выработки антител против ВИЧ-2 у животных, включая человека. Синдром приобретенного иммунодефицита /СПИД/ является самой важной проблемой всемирного здравоохранения. Этиологический агент СПИДа назвали ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), название, которое относится к группе очень близких вирусов, которые раньше называли HTLV - III, LAV и ARC (теперь общее название ВИЧ-1).

Относящиеся к СПИДу комплексы из Северной Америки, Западной Европы и Центральной Африки обычно имеют одинаковые биологические свойства и антигенно перекрестно-реагирующие протеины. Однако генетические исследования показали различия в нуклеотидной последовательности геномов изолятов североамериканского и африканского ВИЧ. Кроме того, описаны небольшие различия в нуклеотидных последовательностях в изолятах различных ВИЧ из Америки.

Недавно выделены несколько вирусов, генетически и структурно относящихся к ВИЧ. Эти вирусы, которые генетически и иммунологически напоминают ВИЧ. выделили из макак резус /Масаса mucatta/. которые болели СПИДом, подобным заболеванию здоровых диких африканских зеленых мартышек /Cercoplthecus sp./. Ви00

ю ел ю

Јь

со

русы, которые раньше назвали как STVV- IIIAGH изолят африканских зеленых мартышек и STW-IIIMAC /изолят макаки/, теперь известны как ВИО /вирус иммунодефицита обезьяны/.

Новый вирус человека, названный HTLV-IV, выделили у кажущихся здоровыми людей в Западной Африке. Этот вирус, который вырабатывает в инфицированных клетках частицы типа ретровируса, имеет характеристики роста, основные вирусные протеины, аналогичные этим параметрам у HTLV-III/LAV и STLV. Серологические данные показывают, что HTLV-IV имеет больше сходства с STLV-IIIACM, чем с прототипом HTLV-III/LAV, выделенным из больных в Европе и США.

Африканские больные.

Несмотря на то, что у пациентов наблюдаются классические симптомы СПИДа, в их сыворотке нельзя обнаружить заметные титры антител к известным антигенам ВИЧ. Однако ретровирус, первоначально названный LAV-2 и структурно и биологически относящийся к ВИЧ, выделили у пациентов в Западной Африке. Западноафриканский вирус, который в настоящее время выделен у ряда больных СПИДом, АРС и не имеющих симптомов какого-либо заболевания, теперь известен как ВИЧ-2 для того, чтобы отличить его от ВИЧ /теперь ВИЧ-1 /, ранее индентифицированного как этиологический агент СПИДа в Европе. Сеперной Америке и Центральной Америке.

Также как HTLV-IV ВИЧ-2 ближе к ВИО. чем к ВИЧ-1. Однако ВИЧ-2 и HTLV-IV не являются одним и тем же вирусом, поскольку ВИЧ-2 убивает Т-хелперы человека, зараженные in vitro, a HTLV-IV - нет.

Полная нуклеотидная последовательность ВИЧ-2, которая была недавно опубликована, показывает гомологию генетической последовательности с ВИЧ-1 только42%. Значительные различия имеются в большинстве вирусных белков, но наиболее выражены в глюкопротеидах, кодированных генами оболочки ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Фактически, по-видимому, глюкоп- ротеиды оболочки ВИЧ-2 более тесно связаны с глюкопротеидами ВИО, чем с ВИЧ-1.

Исследование отсутствия серологической перекрестной реактивности между ВИЧ-1 и ВИЧ-2 имеет очень большое значение при разработке диагностических тестов на заражение ВИЧ-2 и вакцин против ВИЧ- 2. Исследования показали, что больные, зараженные ВИЧ-2. не выявляются с помощь тррологических тестов, определя0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ющих ВИЧ-1. Любые перекрестные реакции, которые наблюдали между этими двумя вирусами, обычно осуществляются за счет антител, которые вступают в реакцию с общими эпитопами на основных протеинах ядра, Р25 и Р26. кодированных геном gag этих двух вирусов. Антитела к глюкопротеидам вирусной оболочки Р120 и Р41 и их предшественнику Р160 не вступают в перекрестную реакцию с глюкопротеидами оболочки ВИЧ- 2.

Имеющиеся в настоящее время тесты для обнаружения ВИЧ-1, которые, в основном, основаны на обнаружении антител к глюкопротеидам ВИЧ-1, например др160, др120 и др41 и их частям, нельзя использовать для обнаружения антител к ВИЧ-2 в пробах для целей диагноза и скрининга. Таким образом, специфичные антигены ВИЧ-2 должны включаться с антигенами ВИЧ-1 в реагенты для эффективного диагностического и терапевтического применения.

Разработанные для обнаружения заражения ВИЧ-2 способы в общем случае измеряют воздействие на вирус обнаружением и количественной оценкой антител к антигенам ВИЧ-2 в крови, сыворотке и полученных из крови продуктах. Такие тесты можно использовать для диагностики СПИДа и АРС /СПИД-связанный комплекс/ и для скрининга крови и препаратов крови для предыдущего воздействия вируса ВИЧ-2.

Существующие попытки диагностировать заражение ВИЧ-2 и фильтровать кровь для воздействия ВИЧ-2 включают методы иммунной пробы, связанной с ферментом /ELISA/. предназначенные для определения присутствия антител к иммуногенным компонентам ВИЧ-2 в контрольной пробе. Другие способы могут использовать методы с фильтровальной бумагой Вестерна, предназначенные для определения специфических антител ВИЧ-2 в контрольных пробах. В общем случае, можно применить почти все известные иммунопробы, такие как ра- диоиммунопробы. используя специальные реагенты для обнаружения ВИЧ-2 и антител к нему.

Источники антигенов для этих испытаний могут включать Inter alia протеины ВИЧ- 1, полученные из линии Т-клеток, зараженных ВИЧ-2, и антигены, полученные методом рекомбинантной ДНК. Однако использование антигенов, полученных из этих источников, имеет значительные недостатки.

Получение самого ВИЧ-2 в непрерывных линиях клеток должно осуществляться

в лабораториях повышенного риска /загрязнение РЗ/ из-за опасности для исследователей, которые могут подвергнуться воздействию этого вируса; кроме того, поскольку сообщается о ложных положительных и отрицательных результатах при тестах ELISA при использовании антигенов ВИЧ-1 целого вируса, полученных из линий клеток, вероятно, такие недостоверные результаты будут получаться с полученными с клетки ВИЧ-2 антигенами. Анализ пятен Вестерна для обнаружения ВИЧ-2 с применением электрофильтруемых целых вирусных антигенов, может обеспечить большую специфичность, но является более трудоемким и длительным,чем тесты ELISA. Более того, поскольку вырабатывающие ВИЧ-2 клетки имеют человеческое происхождение, препарат вирусного антигена, полученного из этих линий клеток, если не подвергается очень тщательной очистке, может загрязняться обычными клеточными антигенами, такими как антигены , что может вызвать ложные положительные реакции в тесте ELISA.

Исчерпывающая очистка вирусных антигенов из линий клеток может также разрушить иммуногенность иммунологически важных протеинов или иначе неактивных антигенов, вырабатывая тем самым реагенты, которые приводят к ложным отрицатель- ным реакциям. Кроме того, ложные отрицательные реакции, использующие антигены, полученные из живого вируса, могут иметь место из-за стерического препятствия, в результате которого антитела не могут реагировать с их специфическими антигенами, так как реакция блокируется наличием других антигенов и антител в реакционной смеси.

Тесты ELISA для обнаружения ВИЧ-2 могут также использовать иммунологически важные вирусные протеины, полученные клонированием частей генома ВИЧ-2 в бактерии. В настоящее время известна полная нуклеотидная последовательность ВИЧ-2 с кодированием генов для различных ВИЧ-2 протеинов, определяемым сравнением с гомологичными ВИЧ-1 генами. Глюкопротеи- ды вирусной оболочки и протеины ядра соответственно, кодированные env- и gag- генами ВИЧ-2, по-видимому являются антигенами, распознаваемыми антителами а сыворотке больных, зараженных ВИЧ-2.

Иммунологически важные антигены ВИЧ-2, такие как др160 и его продукты расщепления др120 и др41, которые присутствуют в вирусной оболочке, можно получить

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

клонированием частей генома ВИЧ-2 в различных системах экспрессии, таких как бактерия, дрожжи или вирусы вакцины. Такие рекомбинантные антигены можно использовать для диагноза и как потенциальные вакцинные композиции, как было сделано для протеинов ВИЧ-1 /1,2/. Однако антигены ВИЧ-2, полученные методами рекомби- нантной ДНК, все еще требуют опустошающей очистки во избежание ложных положительных реакций в ELISA из-за реактивности любого антитела к антигенам в системе экспрессии, которые могут загрязнять препарат антигена ВИЧ-2..Также, денатурация антигенов ВИЧ-2 во время очистки может разрушать важную антигенную активность.

Хотя антигены ВИЧ-2, полученные ре- комбинантными методами, могут быть улучшением по сравнению с антигенами, полученными из зараженных вирусом клеточных культур, рекомбинантные протеины могут все еще обеспечивать реагенты, которые позволяют как можно более точно определять диагноз. Из-за характера болезни и необходимости точных результатов необходимо разработать другие реагенты для достижения 100% точности при диагнозе ВИЧ-2.

Протеиновые антигены содержат ряд эпитопов или антигенных детерминант, которые являются областями протеинов, которые включают сайты связи для специфических антител. В общем случае. протеиновые антигены содержат 5-10 эпи- топ. каждая из которых содержит последовательность 6-8 аминокислот. Эпитопы могут быть непрерывными, в которых 6-8 аминокислот присутствуют в линейной последовательности, или прерывистыми, в которых аминокислоты, которые образуют эпитоп, сведены вместе трехмерной укладкой протеина. Даже когда эпитоп состоит только из относительно небольшого числа аминокислот, его реактивность с антителом подвергается воздействию аминокислот в протеине, который окружает эпитоп.

Исследованиям, целью которых было вычерчивание антигенных сайтов или эпитопов протеинов, помогло применение синтетических пептидов, соответствующих различным областям представляющих интерес протеинов.

В дополнение к их полезности в исследованиях вычерченных эпитопов, синтетические пептиды, если включают большинство антигенных детерминант протеина, имеют потенциал как иммуногенные

композиции, включая вакцины, и диагностические реагенты. Антигены синтетического пептида имеют несколько достоинств по отношению к получению специфического антитела и реактивности. Точную последовательность синтезированного пептида можно выбрать из последовательности аминокислот, фактически определенной из аминокислотной последовательности протеина или предсказанной из кодирования ДНК-последовательности для протеина. Использование специфических синтетических пептидов исключает необходимость применения протеина полной длины в получении специфических антител или в их испытаниях. Далее, методы синтеза твердофазного пептида Меррифельда и его сотрудников позволяют химически получить, по существу неограниченные количества представляющего интерес синтетического пептида. Дополнительные преимущества такого способа заключаются в доступности автоматических синтезаторов пептида.

Синтетические пептидные антигены, соответствующие областями иммунологиче- ски важных протеинов ВИЧ-2, найдут немедленное применение в диагностических методах, а.также в качестве возможных вакцин для ВИЧ-2.

В соответствии с изобретением получают новый синтетический пептид, соответствующий антигенному ВИЧ-2 протеину, полезный в выбранных диагностических методах для обнаружения заражений ВИЧ-2.

Новый синтетический пептидный антиген, соответствующий части глюкопротеида др41, кодированной env-геном ВИЧ-2, обнаружен в настоящее время. Этот пептид полезен для диагностики СПИДа, вызванного заражением ВИЧ-2 у подозреваемых лиц и в методах скрининга для воздействия ВИЧ- 2 в крови и полученных из крови препаратах с высокой степенью надежности и специфичности.

Этот пептид можно использовать в способах обнаружения антител к ВИЧ-2 в пробах. Этиспособы включают контактирование пробы с пептидными антигенами при условиях, которые позволяют иммунологическому комплексу образовываться между пептидом и любыми специфичными к ВИЧ-2 антителами, которые могут присутствовать в данной пробе, Измерение формирования комплекса, если таковое имеет место, при помощи подходящих детекторов, указывает наличие или отсутствие антител к ВИЧ-2 в пробе.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Новый пептид может также быть полезен как иммуноген в вакцинных компози.ци: ях для иммунизации против заражений ВИЧ-2 или для получения в животных ВИЧ-2 специфических антител против антигенов ВИЧ-2.

Изобретение описывает пептид, соответствующий области глюкопротеида трансмембранной оболочки др41 ВИЧ-2, который синтезирован и проверен на иммуно- реактивность к ВИЧ-2 позитивным сывороточным пробам. Новый пептид полезен в испытаниях для диагностики заражения ВИЧ-2 или для предварительного воздействия на вирус и как иммуноген в композициях для стимулирования получения антител против ВИЧ-2 в животных, включая человека. Этот охватываемый изобретением пептид включает аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей один непрерывный /линейный/ эпитоп, реактивный со специфическими антителами ВИЧ-2.

Таким образом, изобретение охватывает иммунологически реактивный пептид и его функционально эквивалентные варианты, которые не влияют в заметной степени на антигенные свойства пептида, соответствующего области др41, кодированной env- геном ВИЧ-2. Пептид был синтезирован известными методами синтеза твердофазного пептида.

Этот синтез также позволяет одной или двум аминокислотам, не соответствующим последовательности исходного протеина, присоединяться к амино- или карбоксильным окончаниям пептида. Такие дополнительные аминокислоты полезны для связи пептида с другим пептидом, с большим протеином носителя или с носителем. Аминокислоты, полезные для этих целей, включают тирозин, лизин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин и их производные. Можно использовать дополнительные способы модификации протеина, например NHj - ацетилирование и-ли амидирование СООН-конца для обеспечения дополнительных средств связи пептида с другой молекулой протеина или пептида или с носителем.

Последовательность нового пептида описана ниже.

Н2-41А5.

X-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly -Cys-Ala- Phe-Arg-Gla-Val-Cys-His-Thr-Thr- Val-Pro-Trp-Val-Asn-Y-Z r где X - водород аминоконцевой МНз-группы пептида или дополнительная аминокислота.

связанная с аминоконцевой МН2-группой пептида, причем эта дополнительная аминокислота выбирается для облегчения связи пептида с протеином носителя; Y - отсутствует или Cys; Z - ОН или NH2.

Пептид Н2-41А5 кодируется нуклеотид- ной последовательностью генома ВИЧ-2, охватывающей пары азотистых оснований /Ьр/ 7908-7978, которая находится в области кодирования генов оболочки для др41. Пептид Н2-41А5. где Х-Н: Y-Cys; Z-OH, предпочтителен.

Этот пептид можно использовать в способах обнаружения антител к связанным с ВИЧ-2 или ВИЧ-2 антигенам. Предпочтительно, методы, которые используют пептид для обнаружения наличия специфических антител к ВИЧ-2 в пробе, включают контактирование пробы с пептидом при условиях, позволяющих образование иммунологического комплекса между антигеном пептида и любыми антителами к ВИЧ-2. которые могут присутствовать в пробе. Формирование иммунологического комплекса, если таковой существует, показывает наличие антител к ВИЧ-2 в пробе и затем этот комплекс обнаруживается и измеряется пригодными средствами.

Такие методы включают, среди других, гомогенные и гетерогенные связанные им- мунопробы, такие как рздиоиммунопробы /РИП/, метод иммуной пробы, связанной с ферментом /ELISA/. и анализ пятен Вестерна. Далее, протоколы испытаний, иЈрЈну.|у- ющие новый пептид, позволяют провести исследования, сравнительные и контрольные связи.

Пептид может быть меченым /генерирующим сигнал/ или немеченым в зависимости от типа используемой пробы. Метки, которые могут быть связаны с пептидами, относятся к разряду известных в технике и включают, среди прочих ферменты, радиоизотопы, фторогенные или хромогенные вещества, коферменты, биотин/авидин, коллоидное золото и магнитные частицы. Модификация нового пептида позволяет осуществлять связь известными средствами с протеинами или пептидами-носителями, или с известными носителями, например полистироловые или поливиниловые микротитровальные пластины,стеклян- ные трубки или стеклянная дробь, и хроматографическими носителями, такими как бумага, целлюлоза и производные целлюлозы и кремнезем.

Предпочтительными известными методами анализа, особенно для крупномэсш0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

табного клинического скрининга крови и полученных из крови препаратов, а также сыворотки, являются методы ELISA и пятен Вестерна. В частности, предпочтительным является метод ELISA. Испытания ELISA, использующие пептид Н2-41А5. описанный выше, основаны на методах, используемых в настоящее время с полученными из клетки человека или из рекомбинантной ДНК ВИЧ- 1 протеинами или их частями в качестве антигенов. Для использования в качестве реагентов в этих пробах пептид H2-4IA5 обычно связывают с внутренней поверхностью мик- ротитровальной лунки. Пептид может быть прямо связан с микротитровальной лункой. Однако установлено, что максимальную связь пептида с лунками можно получитьб предварительной обработкой лунок полили- зииом до добавления пептида.

Пептид Н2-41А5 может быть ковалент- но соединен известными методами с протеином-носителем, таким как альбумин бычьей сыворотки, используемым для покрытия лунок. Обычно пептид используется в концентрации 10-100 мг/мл для покрытия.

Пробы, которые должны испытываться на антитела к ВИЧ-2, затем вводят в покрытые пептидом лунки, где образуется иммунологический комплекс, если в пробе присутствуют антитела к ВИЧ-2. Для того, чтобы помочь обнаружить образование комплекса, можно ввести средства генерирования сигнала. Обнаруживаемый сигнал вырабатывается, если в пробе имеются специфические антитела к ВИЧ-2,

Изобретение иллюстрируется следующими специальными примерами, которые ни о коем случае не ограничивают обьем защиты изобретения.

Пример 1. Для синтеза пептида Н2-41А5 использовали синтезатор пептида 430А фирмы Эпплайд биосистема. В синтезе использована п-метилбензилгидрила- миносмола на твердофазном носителе. Все аминокислоты для использования в синтезе содержали третбутилкарбонильные группы /t-Вос/, защищающие a-NH2-rpynny. Аминокислоты с реакционноспособными группами с боковой цепью содержали дополнительные защитные группы для предотвращения нежелательны и ненужных реакций боковой цепи. Отдельные защищенные аминокислоты, использованные для синтеза пептида Н2-41А5, выбирались из следующих (Boc-Glu/OBZI/-OH. Вос-11е- ОН 1/2 НзО, Boc-Lys -/2-OZ/-OH (кристаллическая), Boc-Met-OH и Бос-Туг

-/2-Br-Z/-OH, не использовались в синтезе пептида Н2-41А5):

Аминокислоты, используемые в синтезе пептида:

Вос-А1а-ОН Boc-Arg(Tos)-OH Boc-Asn-OH Boc-Asp(OBZI)-OH Boc-Cys-(pMeOBZI)-OH Boc-Glu(OBZI)-OH Boc-Glu-OH Boc-G y-OH Boc-His(Tos)-OH Boc-Fle-OH 1/2H20 Boc-Leu-OH H20

Boc-Lys(2-CI-Z)-OH /кристаллическая/ Boc-Met-OH Boc-Phe-OH Boc-Pro-OH

Boc-Ser-{BZI)-OH DOHA Boc-Thr(BZI)-OH Bo:-Trp /формил/-ОН Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH - Boc-Val-OH

То5 тозил или р-толуолсульфокислота OBZI-бензилоксИ pMeOBZNn-метилбензилокси 2-CI-Z карбобензоксихлорид 2-Br-Z карбобензоксибромид

После завершения синтеза защитные группы удалили из синтезированного пептида и пептид оущепили от смолы на твердом носителе обработкой при 0°С безводной плавиковой кислотой (HF). используя в качестве удаляющих агентов совместно 10% анизола и 10% диметилсульфида. В качестве дополнительного удалителя добавили 2% тиокрезола, так как Н2-41А5 является содержащим цис- теин пептидом.

После отщепления HF в пробе промыли под струей N2 с удалением любой остаточной HF при помощи воздействия на пробу вакуума при 0° С. Пептид экстрагировали из смолы обработкой трифторуксусной кислотой /TFA/. которую затем удалили испарением при комнатной температуре. После удаления TFA пептид осадили и промыли безводным простым эфиром.

До использования в специальных пробах пептид можно дополнительно очистить, если необходимо, при помощи обращенно- фаэовой скоростной жидкостной хроматографии. Очень подходящей колонной для такой очистки служит обращеннофазовая колонна Vydek C-18. использующая для

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

элюирования пептида градиент вода /TFA/- ацетонитрил /TFA/,

П р и м е р 2. Пептид Н2-41А5, имеющий последовательность аминокислот Asp-Gln- Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe- Arg-Gln-Val-Cys-Hls-Thr-Thr-Val-Pro-Trp-Val -Asn-Cys-OH, синтезировали как описано в примере 1 и использовали в испытании Е LISA для измерения его иммунологической реактивности.

На микротитровальные пластины внесли полилиэин в концентрации 1 мг/мл и выращивали 30 мин. Полилизин затем удалили и в лунки пластин добавили пептид Н2-41А5 в концентрации 10-100 мг/мл для покрытия. После того.как пептид выращивали в лунке в течение времени, достаточного для связи пептида с лункой, пептидный раствор удалили и 15 мин добавляли раствор глутаральдегида. который стабилизует присоединение пептида к лункам. Затем раствор глутаральдегида удалили, лунки промыли буферным раствором и добавили смесь глицина и альбумина бычьей сыворотки, которая служит для блокировки несвязанных сайтов в лунках и минимизации неспецифическай связи антител в течение самого испытания ELISA. После последней операции промывки пластины были готовы к применению.

Обычная вариация известных методов ELISA использовалась с приготовленными микротитровальными пластинами. Пробы сыворотки отдельных лиц, разбавленные 1:50 в PBS /фосфатно-буферный соляной раствор/, содержащем 0,05% полиоксиэти- ленсорбитмонолауарата /Твин 20/ и 1 % альбумина бычьей сыворотки, вносили в каждую лунку и выращивали 90 мин при 37°С во влажной атмосфере. Разбавленные пробы сыворотки затем удалили из пластин и лунки промыли три раза PBS, содержащим 0.05% Твин 20. В лунки затем добавили коньюгированное античеловеческое 1 g антитело и выращивали 90 мин. Коньюгированное антитело получали в козле или кролике и специфицировали для человеческих IgG. IgM иммуноглобулиновых легких цепей или их комбинаций. Предпочтительно, в ELISA использовали связанный с щелочной фосфатазой античеловеческий IgG /из Dabopatts/, разбавленный 1:500 в PBS, содержащем 0,05% Твин 20 и 1 % альбумина бычьей сыворотки. После того, как конью- гант выращивали достаточно времени для реакции со связанными антителами человека, пластины промыли три раза. Для обнаружения антител к ВИЧ-2 в человеческой

сыворотке, которая реагирует с пептидом Н2-41А5, использованном как антиген /т.е. положительные реакции/, добавили хромо- генный щелочно-фосфэтэзный субстрат /таблетки N; 104 Sigma Cot/, растворенный в буфере карбонат натрия /MCI и подрегулированный до концентрации 1 мг/мл, который был отщеплен ферментом, присоединенным к античеловеческому IgG для получения цветного продукта. Желтый- оранжевый - красно-коричневый цвет в каждой лунке, показывающий положительную реакцию, считали з спектрометре при 405 нм для количественной оценки реакции. Спектрометрические отсчеты подстроили для корректировки фоновых реакций.

Пептид Н2-41А5 использовали в параллельных ELISA относительно б сывороточных проб, положительных для антител к ВИЧ-2. 10 сывороточных проб, положительных для антител к ВИЧ-1,и 6 отрицательных к ВИЧ-1 /ВИЧ-2 сывороток. Как показано в таблице,6/б подтвержденных положительных ВИЧ-2 сывороточных проб /100%/ про- -реагировали с пептидом Н2-41А5. Таблица также показывает, что ни одна положительная к ВИЧ-1 сывороточная проба и ни одна

30

.

ИммунореактИвность пептида Н2-41А5 по отношению к ВИЧ-2, положительным ВИЧ-1-и положительным и отрицательным пробам сыворотки, определенная при помощи метода

иммунопробы, связанной с ферментом

отрицательная сыворотка не реагировала с Н2-41А5.

Из приведенных результатов очевидно, что новый синтетический пептид, описанный Н2-41А5. который соответствует области глокопротеида др41 ВИЧ-1, кодированной геном оболочки, явно обеспе- чиваетуникальный реагент для чувствительного и избирательного анализа на присутствие антител к ВИЧ-2.

Формула изобретения

Способ обнаружения антител к ВИЧ-2, включающий проведение иммунофермент- ного анализа исследуемой пробы с антигеном и последующую оценку образовавшегося иммунного комплекса, о т личающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, в качестве антигена используют полипептид X-Asp-Gln-Ala-Arg- Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Ary- Gln- Val-Cys-Hts-Thr-Thr-Val-Pro-Trp-Val-Asn-Y- Z, где X - водород аминоконцевой группы пептида или дополнительная аминокислота, связанная с аминоконцевой МН2-группой пептида; Y - Cys; Z - ОН.

Прим е ч а н и е. Пептид Н2-41А5 покрывали при концентрации 10 мг/мл

Продолжение таблицы