Способ определения триазиновых гербицидов Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 C07D213/00 C07D251/50 

Изобретение относится к иммунологи- чес кому способу определения веществ в ок- ру)ающей среде, в частности средств для зациты растений в питьевой или грунтовых водах.

| Атразин представляет собой белый порошок без запаха. Химическое название его 2-Х1ор-4-этиламино-6-изопропиламино-1,3, ,5-1риазин. В течение вот уже 30 лет он ши зоко используется в качестве гербицида. Механизм действия его заключается в по- даЕлении фотосинтеза, в результате чего сорняки быстро засыхают, Атразин ис- по; ьзуется, в частности, для уничтожения сорняков на кукурузных полях. Так, в ФРГ 90 э всех площадей, занятых под кукурузу, обрабатывается атразином,который,таким образом, при годовом расходе 1000 т занимает первое место среди других гербицидов. Наряду с атразином применяются и другие гербициды, производные триазина, присутствие которых обнаружено в грунтовых и поверхностных водах.

Долгое время считалось, что производные триазина после обработки ими растений постепенно разлагаются и связываются с частицами почвы, и загрязнение ими грунтовых вод, таким образом, исключено. На практике однако оказалось, что эти соединения являются стабильными: время, за которое в почве распадается половина активного вещества, составляет 2-5 месяцев. Из песчаных, а также глинистых и суглинистых почв активное вещество довольно легко вымывается грунтовыми водами, в результате чего остатки триазина могут обнаруживаться в грунтовых водах и через

00

со

00 4 00 XI

СО

несколько лет. При этом для отдельных веществ верхний предел составляет 0,0001 мг/л (100 нг/л), а суммарное содержание этих веществ не должно превышать 0,0005 мг/л (500 нг/л).

Для точного аналитического определения чувствительность анализа должна быть ..до двух порядков ниже этого значения. Из- за большого количества веществ, которые нужно определять, и низких предельных концентраций возникает однако серьезная проблема определения их химическими методами. Физико-химические методы анализа (газовая хроматография,. сочетание газовой громатографии и масс-спектромет- рии, высокопроизводительная жидкостная хроматография} для идентификации и количественного определения химических веществ требуют трудоемких методов концентрирования. Кроме того, они очень дороги и трудоемки. К .тому же эти методы не дают возможности судить о токсичности анализируемых соединений.

Современные биохимические методы анализа представляют собой иммунологи- ческие тесты (так называемый иммуно-эна- лиз), в которых в качестве испытуемых соединений используются части клеток. Им- мунологические методы анализа для анализа вод являются высокочувствительными и наиболее быстрыми и дают возможность быстро, эффективно и с сравнительно небольшими затратами осуществлять мониторинг окружающей среды.

Иммунотесты представляют собой высокочувствительные системы для количественного определения вещесто. основанные на реакции антиген-антитело. Для осуществления иммуноанализа вначале индуцируют антитела путем иммунизации лабораторных животных и затем получают их из сыворотки этих животных или продуцирующих их лимфоцитов. Очистку антител осуществляют на колоннах для аффинной хроматографйи, содержащих в качестве материала-наполнителя, например агарозу. Антитела представляют собой одну из природных защитных систем высших животных организмов. Защитная функция основана на том, что при прививке естественной или искусственной инфекции индуцируются специфические антитела. Предпосылкой образования антител является определенная величина молекул. Для индуцирования образования специфических антител по отношению к очень маленьким молекулам, например средствам для защиты растений, их гаптены перед иммунизацией необходимо закрепить на молекуле-носителе с высоким молекулярным весом, например белке

(гемоцианмн, альбумин бычьей сыворотки, альбумин яйца, тироглобулин, полилизин и

ДР-).

Для определения химического вещест- ва используют только такую связь антиген- антитело, которая возникает при добавлении к антителу пробы, содержащей химическое вещество, являющееся антигеном. В классическом иммуноанализе опре

деляемые антигены конкурируют с

аналогичными по специфичности антигенами, меченными радиоактивной меткой, за места связи на антителе. В последнее время наряду с радиоиммунным анализом (РИА)

5 большое значение приобрел ферментный иммунный анализ (ФИА), в котором антиген с радиоактивной меткой заменяется конью- гатом фермент-антиген, который затем может конкурировать за свободные места

0 связи на антителе с антигенами пробы. При таком конкурирующем ФИА происходит конкуренция между определенным количеством меченного ферментом антигена.и антигеном пробы за места связи на антителе.

5 которые в свою очередь за счет адсорбционных или ковалентных сил связаны с поверхностью носителя, например поверхностью полистирола. При небольшой концентрации антигенов в пробе с антителом связывается

0 большое количество ферментной метки (высокая степень расхода субстрата) и, наоборот, при высокой концентрации антигенов в пробе с антителом связывается лишь небольшое количество ферментной метки

5 (низкая степень расхода субстрата). Инги- бирование связи ферментной метки является, таким образом, функцией концентрации антигенов в пробе. После отделения несвязанной ферментной метки путем отмывки

0 можно по степени расхода субстрата определить долю связанного меченного ферментом антигена и тем самым концентрацию антигена в пробе. Мерой количества связанной ферментной метки является абсорбция

5 прореагировавшего субстрата. С помощью вышеописанной техники индуцируют специфические по отношению к различным пестицидам антитела, а иммуноанализ, являясь быстрым, высокоселективным и тем

0 самым сравнительно недорогим методом анализа, дает решение проблемы определения этих веществ. Нередки однако случаи, когда однозначная идентификация и количественное определение на основе пере5 крестных реакций с помощью такого иммуноанализа невозможны, Под перекрестной реакцией имеется в виду явление, за- ключающееся в том, что антитела распознают одинаковые функциональные группы в молекулах различного строения,

группируя эти различные молекулы по принципу одинакового воздействия. При этом однако нельзя сделать различия между отдельными молекулами. Особенно ярко этот Эффект проявляется в случае небольших мо- еку л (антигенов), так как они должны быть вязаны с матрицей (белком), и поэтому познавательным регионом является не вся олекула, а лишь ее отвращенная от матри- ы сторона. В результате молекулы с одинаковой структурой у этой отвращенной стороны часто становятся неразличимыми с помощью иммуноанализа. С другой стороны, во многих случаях перекрестная реакция является как раз желательной, так как с ее помощью можно определять не только гнтигены, используемые специально для получения антитела, но и соединения аналогичного химического строения или с такой же биологической активностью, как и ис- гользуемый антиген. Целенаправленно п рименяя перекрестные реакции, в ходе од- н ого теста можно определять различные, но относящиеся по воздействию к одному классу вещества. Это особенно ценно при необходимости оценки токсичности еще неизученных соединений. Благодаря этому свести к минимуму опыта на животных и биологические тесты, так с помощью вышеописанного принципа разделения на классы по действию становится возможным сделать предварительную опенку экотокси- к элегической опасности еще неисследованных соединений.

Задачей настоящего изобретения явля- е|гся разработка иммунологического спосо- б|а определения, с помощью которого можно было бы определять триазиновые гербициды и соединения с аналогичным химическим строением или одинаковой биологической активностью, относящиеся по действию к одному классу, и который бы в то же время позволял однозначно идентифицировать отдельные химические соединения в сложных смесях.

Решением указанной задачи является иммунологический способ определения соединений формулы

Ј

, /

5

О

V

/5-

I в которой

| X , X , XJ означают атом углерода или аз|ота

| X , X , X атом углерода; Ri - группу HN(CnH2n i). причем п означает целое число

от 0 до 8, М СпЬ щм причем п означает целое число от 1 до 8, HN-CnH2nY, причем Y означает циано-, амино- или СООН-группу, a h целое число от 1 до 8, CxP2xZ, причем Z 5 означает циано-, амино- или СООН-групиу, а X целое число от 1 до 8, азид, атом галогена, SH-группу, ОН-группу или группу HN- СбН4С1; R2 - группу HNCqH2q-n, причем q означает

0 целое число от 0 до 8, N(CrH2r+i)2, причем г означает целое число от 1 до 8, HN-CqH2qY, причем Y означает циано-, эмино-, азидо- или СООН-группу, a q целое число от 1 до 8. N-CrH2rM Z, причем Z означает цианоами5 но-, азидо- или СООН-группу или группу CqH2q. a r и q целое число от 1 до 8, азид, атом галогена, SH-группу или ОН-группу; Вз - атом галогена, ЗСлН2п+1. причем п означает целое число от 0 до 8, ОСпН2л-н, при0 чем п означает целое число от 0 до 8, циано- карбоксильную, амино- или СНО- группу, причем заместитель Нз может находиться в мета-положении относительно RI и R2 или в орто- или пара-положении относи5 тельно Ri nR2, отличающийся тем. что закреплением указанного соединения (I) (антигена) на матрице через заместители Ri, R2 или РЗ экспонируется только часть его молекулы: иммунизацией подопытных жи0 вотных получают антитела А, В, или С, пред- почтительно реагирующие на эту экспонированную часть молекулы соединения (I), и для иммунологического определения соединения (I) предположительно

5 содержащую его пробу в сериях опытов одновременно или в различной последовательности подвергают взаимодействию с по меньшей мере двумя из вышеуказанных антител А, В, или С и на основании образова0 ния в сериях опытов связи антиген-антитело проводят количественное и качественное определение соединения (I). По предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения соединение формулы (I)

5 представляет мета-замещенное шестизвен- ное ароматическое кольцо, содержащее до трех ато мов азота. Наиболее предпочтительными при этом являются производные пиридина, пиримидина или триазина.

0По предпочтительному варианту осуществления предлагаемого способа для иммунологического определения три антитела А, В и С используются в сериях опытов в следующей последовательности: первая серия:

5 ABC; вторая последовательность: ВСА; третья последовательность: CAB;

При этом пробу с определяемым веществом по отдельности подвергают взаимодействию с каждым из указанных антител. Для этой цели исследуемые растворы можно вводить с помощью пипетки в реакционные сосуды или полости пластин для микротитрования с находящимися в них соответствующими антителами.

По другому предпочтительному варианту осуществления способа исследуемую пробу вначале подвергают взаимодействию с первым антителом из каждой серии, затем отделяют непрореагировавшую надосадоч- ную жидкость и подвергают ее взаимодействию со следующим антителом серии.

В отдельных случаях при проведении предлагаемого способа может оказаться целесообразным с помощью гибридной техники, путем переработки полученных из подопытных животных сывороток или продуцирующих антитела лимфоцитов получать моноклональные антитела и уже их использовать для анализа.

Иммунологический способ в соответствии с настоящим изобретением, при исполь- зовании реакционной способности к перекрестным реакциям, наряду с соединениями (1) позволяет проводить анализ и других соединений аналогичного строения, относящихся к тому же классу соединений, а также соединений отличного строения, которые однако обладают такой же биологической активностью и аналогичным поведением в отношений образования связей.. .

Иммунологическое определение с использованием реакции антиген-антитело по способу в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно проводят с помощью антигена с радиоактивной меткой или антигена, связанного с ферментом, флуоресцирующим соединением или веществом, генерирующим электрические сигналы (биосенсором), В ходе анализа происходит конкуренция антигена пробы и меченного или связанного антигена (реактива) за места связи с антителом. После этого несвязанный с антителом свободный реактив отмывают и, измеряя интенсивность радиоактивного излучения, величину, абсорбции, флуоресцентное излучение или электрический сигнал, определяют тем самым количество связанного реактива и, сле- довательно, концентрацию антигена в растворе.

Иммунологический способ определения в соответствии с настоящим изобрете- нием позволяет проводить анализ соединений определенного класса активности и в то же время идентифицировать от- дельные вещества этого класса. Он представляет собой быстрый, высокоселективный и недорогой способ, с помощью которого можно проводить анализ большого

количества веществ, находящихся в окружающей среде, чего невозможно, несмотря на автоматизацию, сделать с помощью обычных аналитических методов. Положенные в

основу способа принципы позволяют проводить оценку экологической токсичности еще неисследованных соединений, классифицируя их по активности.

Более подробно изобретение поясняется на следующих примерах.

Пример. Описаны получение трех различных антител А, В и С, каждое из которых предпочтительно воздействует на одну из частей молекулы гербицида атразина, наиболее характерного представителя соединений формулы (I), а также вариант осуществления предлагаемого в соответствии с настоящим изобретением иммуноло- гического способа определения.

Для получения антитела А, предпочтительно воздействующего на часть молекулы атразина

- К 1

Н5Сг 5н((ЗДг

(П)1

вначале проводят реакцию сульфоксидиро- вания метилтиоэфирной группы триазина аметрина нздкислотой и затем непосредственно закрепляют модифицированный таким образом аметрин на альбумине бычьей сыворотки. Аналогичным образом для пол- учения антитела В, предпочтительно реагирующего на часть молекулы атразина

40

-ДСЧ

H-BT njr ci ш)

чА

одну из этиламино-групп триазина симази- на с помощью карбодиимидного способа

45 связывают с белком. И, наконец, антитело С. предпочтительно реагирующее на часть молекулы атразина может быть получено путем связывания гербицида пропэзина с матрицей через изопропиламиновые группы.

50„ ч,

-xCWfe

(CHjj

H-f (Ю

гт

Полученные вышеописанным образом коньюгаты вводятся для индуцирования антител А, В и С подопытным животным (кроликам), которые затем получаются из сыворотки иммунизированных животных

известными способами, в частности с помощью аффинной хроматографии, с исполь- ованием заместителей в соответствии с юрмулой (1).

Полученные антитела абсорбируют на оверхности полистирола полостей пластин ,ля микротитрования. Для этого растворл- эт антитела в карбонатном буфере Ма2СОз/№НСОз 50 ммоль/л; рН 9,6), до- 1авляют в полости пластины для микротит- Овэния пипеткой по 0,25 мл полученного створа, оставляют пластины на ночь при омнатной температуре и на следующий ,ень промывают их TBS-буфером. Хорошо одготовленные пластины хранят сухими ри -20°С. Для анализа в полости вносят 80ул пробы исследуемого водного раство- а (концентрация определяемого вещества т 1 мкг/л до 200 мг/л) и добавляют по 50 лкл ферментной метки, представляющей обой конъюгат щелочной фосфатазы и три- зина, природа которого определяется в за- исимости от выбранного антитела. Если нэлиз проводят с антителом А, то с ферментом связывают аметрин. При работе же антителом В или С применяют соответст- енно симазин или пропазин.

Резким встряхиванием микротитро- альной пластины в горизонтальной плоско- ти смешивают растворы. После инкубации течение еще часа при 209С удаляют путем этмывки TBS-буфером (50 ммол/л трис/ок- :иметил/-аминометана, 1 ммол/л MgCla, 50 ммол/л NaCI, рН 7,8 за счет HCI, 0,05 % полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат) все не связанные с антителом молекулы. Для количественного определения связанного меченного фермента в полости добавляют по 125 мкл раствора субстрата фосфатазы (1 мг n-нитрофенилфосфата на мл крабонатного буфера). Ферментная реакция протекает при 20°С. Ее однако можно ускорить инку- эацией при повышенной температуре. Поглощение раствора в полостях определяют |с помощью фотометра с вертикальным пучком света, при длине волны 405 км. | Для того, чтобы повысить чувствительность, рекомендуется оставлять пластины на ночь при 4°С. При этом однако следует считаться с тем, что если не предъявлять специальных требований к чистоте реактивов, приборов и помещения, то невозможно добиться воспроизводимых результатов при концентрациях порядка м.т. | Расчет концентрации антигена в пробе | производят исходя из следующих сообра- |жений. Меченный ферментом антиген связывается прежде всего с теми местами |антитела, которые остаются свободными |после инкубации его с антигеном пробы.

Так, при высокой концентрации антигенов пробы связывается лишь небольшое количество ферментной метки. При низкой же концентрации антигенов пробы, наоборот,

связывается большое количество фермент- ной метки. Количество связанной ферментной метки является, таким образом, функцией концентрации антигена в пробе. Мерой количества связанной ферментной

0 метки служит величина абсорбции прореагировавшего субстрата (цветная реакция с переходом от бесцветного к желтому цвету). Расчет. Отношение абсорбции определяемой () и нулевой проб

5 (BOABQ-AVB)

B/BO(AB-AVB);(ABO-AVB).

где В/ВО - отношение количества связанной ферментной метки в присутствии антигена (В) к количеству связанной фер.0 ментной метки в отсутствии антигена (ВО); ABO абсорбция (при 405 нм) в качестве меры количества связанной ферментной метки в отсутствии антигена (ВО): Ав - абсорбция (при 405 нм) в качестве меры

5 количества связанной ферментной метки в присутствии неизвестной концентрации антигена (гербицида) в пробе; АОВ - абсорбция (при 405 нм) в качестве меры количества связанной ферментной

0 метки в отсутствии париетальных антител. Если нанести значения В/ВО по оси у относительно логарифма концентрации гербицида, то получается сигмоидная кривая. Для спрямления кривой для большего удоб5 ства работы предложено по оси у также откладывать логарифмические значения (логарифмические координаты). Для оценки однако оказалось целесообразнее выражать степень торможения (1-В/ВО) через интег0 рал нормального распределения. На практике для этой цели вместо частоты на вероятностную бумагу наносят процентное торможение (100 /1-В/ВО). В результате происходит спрямление сигмоидной кри5 вой.

Для определения антигена в пробе в отдельных опытах исследуемую пробу обрабатывают по отдельности или в определенной последовательности каждым из

0 используемых антигенов. В случае последнего способа оказалось, что в каждой серии опытов одна и та же степень ингибирования наблюдается, когда экспонированные части молекул, по отношению к которым являются

5 активными различные антитела, находятся в различных молекулах. Если же по меньшей мере две экспонированные части находятся в одной молекуле, то наблюдается разброс. Это объясняется тем, что молекула, содержащая две такие экспонированные части,

вследствие связывания с антителом как за счет одной, так. и за счет другой части, удаляется из раствора и поэтому после переноса раствора в следующую полость она уже не может принять участия в-связывании. Если рассмотреть все другие возможности связывания, то можно получить следующую матрицу ингибирования (табл. 1), из которой вытекают основные структуры.

Приведенную матрицу ингибирования можно легко расширить за счет применения других антител, что даст возможность анализировать и более сложные молекулы или смеси молекул.

П р и м е р 2. Для того чтобы иметь возможность классифицировать триазины по активности, определяли их реакционную способность к перекрестной реакции по отношению к соединениям, перечислен- ным в табл. 2. Для обеспечения высокой специфичности к атразину иммунизацию проводили таким образом, чтобы происходило специфическое экспонирование ал- кильиого, мзопропилового и этилового остатков. В нижеследующей таблице приведены значения степени ингибирования (%) основных представителей отдельных классов взществ. Прочная связь антигена с ан- гит.-:лом обусловливает и сильное ингибирование ферментной системы. Из величины торможения можно определить степень взаимодействия антитела с антигеном.

Приведенные в табл. 2 значения инги- биропэния свидетельствуют о том. что при указанном концентрации (2 части на млрд)

селективность антител не очень высока, однако перечисленные соединения, которые воздействуют и на фотосистему I I, могут быть определены и иммунологическим методом. С помощью иммуноанализа в соответствии с настоящим изобретением, целенаправленно используя реакционную способность к перекрестной реакции, можно делать выводы о структуре присутствующих в смеси соединений (сравни пример 1). Формула изобретения Способ определения триазиновых гербицидов, включающий постановку иммуно- логической реакции испытуемой пробы с антителами, отличающийся тем, что. с целью повышения селективности и чувствительности способа, используют антител полученные иммунизацией животных соединениями формулы

R.

N

где RI - группа HN(CnH2n+i), где п - 0-8: N(CmH2m+i)2. где m - 1-8, галоген или группа ОН, R2 - группа HNCqH2q+i. где q - 0-8, N(CRH2R-n)2. где R - 1-8. или галоген; Нз - галоген, 5СпН2п+1, где п - 0-8, аминогруппа или HNCmH2mCOOH, где m - 1-8, причем конъюгировзние производят черёз-замести- тели Ri, R2 или Яз, а иммунологическую реакцию осуществляют одновременно или последовательно по меньшей мере с двумя антителами.

Таблица 1

Вторая серия опытов

Третья серия опытов

ABC

+ 4- +

В С А

+ + +

-+ - +

+ + + + + + + + + - +

+ торможение связывания ферментной метки

- отсутствие торможения связывания ферментной метки.

Таблица2

Реакционная способность к перекрестной реакции различных гербицидов при концентрации 2 части на млрд

Матрица ингибирования

AB

+ +

+ - +

+ Независимо друг от друга имеются все части II. Ill, IV

Все части II, 111, IV содержатся в одной молекуле (I компонент)

Части II и III находятся в одной молекуле (2 компонента)

Части II и IV находятся в одной молекуле (2 компонента )

Части III и IV находятся в одной молекуле (2 компонента)