СПОСОБ СВЯЗЫВАНИЯ БЕЛКА Советский патент 2007 года по МПК C12N11/08 B01D15/04 

Изобретение относится к области необратимого связывания белков на сетчатых полиэлектролитах с сохранением биологической активности и может найти применение как один из способов получения высококонцентрированных иммобилизованных белков с сохранением биологической активности.

Известен способ иммобилизации белков пористыми катионитами, основанный на высокоизбирательной сорбции белков при определенных значениях рН и ионной силы раствора для каждого индивидуального белка и катионита. Недостатком способа является то, что сорбированный белок легко вытесняется с катионита при изменении выше указанных параметров.

Целью настоящего изобретения является создание способа необратимой иммобилизации белка в катионите путем химической конденсации белка диальдегидами. Фиксированный таким образом белок не вытесняется из пор катионита при изменении рН, ионной силы, состава раствора или иным способом. Существенно, что в условиях предлагаемого способа полностью сохраняется биологическая активность белка.

Основным отличием изобретения является необратимая иммобилизация белка в катионите с сохранением биологической активности. Указанная цель достигается химической конденсацией диальдегидом сорбированного белка с полным сохранением активности. Используются глутаровый, адипиновый и др. альдегиды в концентрации 0,2-0,5 вес.% - реакция конденсации протекает в условиях наиболее выгодной конформации белка при температуре и при рН, указанных в примерах и постоянном перемешивании раствора.

При применении более низких концентраций диальдегида не удается достигнуть полной необратимой фиксации, в более жестких условиях теряется активность белка.

Предложен способ необратимого связывания белка в пористом катионите, который может быть использован как один из способов получения высококонцентрированных иммобилизованных белков с сохранением биологической активности. Способ иллюстрируется примерами.

Пример 1.

Проводят сорбцию гемоглобина на 1 г сильно набухающего карбоксильного катионита (сополимер метакриловой кислоты и этилендиметакриламида, коэффициент набухания в водородной форме 4, полная обменная емкость 10 мг экв/г) в статических условиях. Сорбция проводится из 0,033 М фосфатного буфера рН=7,4 в течение 17 ч при температуре +4°С. Количество сорбированного гемоглобина оценивается спектрофотометрически при λ=545 нм. В данных условиях одним граммом катионита поглощается 4,5 г гемоглобина. Катионит со связанным гемоглобином отделяется от раствора центрифугированием, промывается водой. Осадок суспендируется в фосфатном буфере рН=7,4. Глутаровый альдегид добавляется до конечной концентрации 0,2%. Реакция конденсации проходит при +4°С, с постоянным перемешиванием раствора. Суспензия катионита с фиксированным таким образом гемоглобином отделяется от раствора центрифугированием и помещается в хроматографическую колонку (1×10 см), через которую пропускается 0,2 м фосфатный буфер рН=8,3 (ионная сила ˜0,6). Отсутствие гемоглобина в элюате свидетельствует о полной фиксации гемоглобина в порах катионита, поскольку в данных условиях гемоглобин, сорбированный на катионите без последующей фиксации, полностью вытесняется с катионита фосфатным буфером заданных рН и молярности.

Пример 2.

Продукт конденсации гемоглобина в пористом катионите, полученный по способу, описанному в примере 1, исследуется на способность таким образом фиксированного гемоглобина к обратимому присоединению кислорода. Предварительно суспензия фиксированного на катионите гемоглобина многократно (до равновесия) промывается 0,1 М фосфатным буфером рН=7,4 (при +4°С).

Спектры, снятые на спектрофотометре СФ-14, окисленной и восстановленной форм гемоглобина, фиксированного на катионите, и соответствующие спектры нативного гемоглобина в растворе - идентичны. На чертеже представлена кривая кислородной диссоциации гемоглобина, характеризующая основную физиологическую функцию гемоглобина - способность к обратимому переносу кислорода. S-образный ход кривой кислородной диссоциации фиксированного на катионите гемоглобина говорит о полном сохранении иммобилизованным белком кооперативности при оксигенации и сохранения способности к обратимому переносу кислорода.

Изобретение относится к области необратимого связывания белков на сетчатых полиэлектролитах с сохранением биологической активности и может найти применение как один из способов получения высококонценитрированных иммобилизованных белков с сохранением биологической активности. Способ осуществляют сорбцией белка на пористом катионите с последующей конденсацией сорбированного белка с диальдегидами. Изобретение позволяет создать способ необратимой фиксации белка на катионите и сохранить при этом его биологическую активность. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ связывания белка путем сорбции на пористых катионитах, отличающийся тем, что, с целью необратимой фиксации белка на катионите и сохранения при этом его биологической активности, проводят конденсацию сорбированного белка с диальдегидами.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве диальдегида используют глутаровый альдегид.