ИММОБИЛИЗОВАННАЯ КАТАЛАЗА Российский патент 1994 года по МПК C12N11/02 C12N9/08 

Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано для научно-исследовательских целей и в производстве препаратов крови для улучшения их качества.

Известна иммобилизованная композиция на основе каталазы, альбумина, связанных с грибным мицелием с помощью глутарового альдегида и комплексирующего буфера, применяемая для аналитических целей и в пищевой промышленности[1].

При стабилизации каталазой препаратов крови (иммуноглобулина и альбумина) происходит улучшение качества препарата (физико-химические свойства). Снижается уровень фрагментации, малонового диальдегида. Однако степень опалесценции не отличается от контроля. Кроме того, введение каталазы в препараты крови ставит задачу освобождения от фермента, так как препараты, применяемые в медицине, не должны содержать в себе посторонних примесей.

Цель изобретения - создание сорбента КИГС-1 на основе иммобилизованной каталазы для улучшения физико-химических свойств препаратов крови.

Это достигается композицией соединений на основе каталазы и иммуноглобулина (химическим путем), связанных с полистиролом (физико-химическим путем), применяемой в соответствие сорбента для очистки препаратов крови от активированных форм кислорода.

Существенными отличиями нового биологически активного вещества (БАВ) являются
устойчивость фермента каталазы в иммобилизованном состоянии;
повышение активности каталазы.

Способ осуществляется следующим образом.

К 5-6 мл раствора иммуноглобулина донорского, разведенного 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-7,4 до концентрации 5-6 мг белка в 1 мл, прибавляют эквивалентный объем раствора каталазы, содержащей 2,8-3,2 мг белка в 1 мл, перемешивают в течение 5-7 мин и по каплям приливают 0,5 мл 1%-ного водного раствора глутарового альдегида; в течение 2,5-3 ч перемешивают при комнатной температуре, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 25-30 мин, надосадочная жидкость представляет собой комплекс иммуноглобулин-катализа. Иммобилизацию комплекса проводят путем адсорбции на гранулы полистирола размером 3х5 мм. С этой целью объем полученной надосадочной жидкости доводят 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-7,2 до 50-60 мл, заливают полистироловые пластины (30-32 г) и оставляют на 18 ч при 4^оС; несвязавшийся белок удаляют промыванием 100-120 мл физиологического раствора, рН 7,0-7,2. Полученным сорбентом КИГС-1 заполняют колонку и пропускают через нее препараты крови при скорости протока жидкости 120-150 мл/ч при температуре 25^оС.

П р и м е р 1. Выбор оптимальной величины рН буфера при получении сорбента КИГС-1.

При получении сорбента КИГС-1 были использованы следующие величины рН комплексирующего буфера: 5,0; 7,0; 7,2; 7,4; 8,6; 9,6.

Как видно из данных табл.1, оптимальной величиной рН комплексирующего буфера является 7,0-7,4.

Кроме того, в результате иммобилизации каталазы и иммоглобулина значительно увеличивается удельная активность фермента. Если до иммобилизации она составила 35000 усл.ед.ак., то после наблюдали активность в 42000 ед. активности.

Применение иммобилизованной каталазы в составе сорбента КИГС-1 для стабилизации препаратов крови.

Полученным сорбентом КИГС-1 (на основе иммобилизованной каталазы) заполняют колонку и пропускают через нее препараты крови при скорости протока жидкости 120-150 мл/ч при температуре 20-25^оС. Данные об эффективности применения сорбента приведены в табл.2, 3, 4, 5.

Как свидетельствуют данные таблиц, эффективность очистки препаратов крови - иммуноглобулина и альбумина сорбентом КИГС-1 превосходит эффективность взятой в качестве прототипа каталазы. Кроме того, использование в качестве стабилизатора сорбента позволяет его многократно использовать для данных целей, причем в аппараты крови не попадают посторонние вещества.

Как свидетельствуют данные табл.3, физико-химические свойства альбумина, пропущенного через сорбент КИГС-1, значительно улучшаются по всем параметрам, в то время, как стабилизированные по способу-прототипу отличаются высокой степенью опалесценции. Пpиведены данные при ускоренном старении препарата (1 месяц при 37^оС).

Пропускание через сорбент КИГС-1 альбумина также способствует увеличению % мономера и препятствует полимеризации альбумина (табл.4).

Как свидетельствуют данные табл.5, пропускание иммуноглобулина через сорбент КИГС-1 на основе иммобилизованной каталазы значительно улучшает физико-химические свойства иммуноглобулина по сравнению с иммуноглобулином, стабилизированным каталазой.

Таким образом, пропускание через сорбент КИГС-1 на основе иммобилизованной каталазы значительно улучшает физико-химические свойства альбумина и иммуноглобулина.

Доказательство свободы активных центров - иммуноглобулина и фермента каталаза в иммобилизованном комплексе иммуноглобулин + каталаза.

Проверку иммунологической активности иммуноглобулина и ферментативной активности каталазы проводили следующим образом.

В лунки полистиролового планшета (фирма Flow) раститровывают антисыворотку кролика к иммуноглобулину человека класса G 0,01 М карбонат-бикарбонатным буфером рН 9,6 до титров 20480, инкубируют. Происходит связывание антисыворотки с полистиролом, несвязавшаяся сыворотка удаляется трехкратным промыванием водопроводной водой и трехкратным промыванием физраствором с детергентом Твин-20 в концентрации 0,05%.

Затем в лунки вносят комплекс каталаза + иммуноглобулин по 0,2 мл. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при 37^оС, несвязавшийся с антисывороткой комплекс каталаза + иммуноглобулин отмывают вышеуказанным способом. В лунки планшетов вносят в качестве индикаторной системы на ферментативную активность каталазы по 0,2 мл 0,025% Н₂О₂ (перекиси водорода) с инкубацией в течение 10 мин при 37^оС, затем 0,2 мл 4%-ного раствора молибдата аммония с инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин. В лунках, где каталаза прореагировала с перекисью Н₂О₂, желтого окрашивания не наблюдается.

Титр препарата в опытах составил 10240. Чем больше иммуноглобулина, тем больше каталазы, тем меньше выражено желтое окрашивание. В контрольных рядах наблюдалось стойкое желтое окрашивание. Следовательно, доказательством действия активного центра иммуноглобулина является его взаимодействие с антисывороткой: сохранность каталазного центра - взаимодействие с перекисью водорода.

Таким образом, данный эксперимент доказывает, что в этом иммобилизованном комплексе остаются свободными активные центры иммуноглобулина и каталазы.

Таким образом, структурная формула иммобилизованного комплекса представляется в следующем виде
K-N=-R-=N-Jg,, где К - остаток каталазы;
I_g - остаток иммуноглобулина;
R - остаток глутарового альдегида.

Каталаза и иммуноглобулин соединяются глутаровым альдегидом, содержащим две альдегидные группы на обоих концах цепи. Эти группы реагируют при нейтральных значениях рН со свободными аминогруппами. Один конец глутарового альдегида присоединяется к лизину каталазы, другой - в лизину иммуноглобулина. С полистиролом связывание происходит физико-химическим путем за счет гидрофобного присоединения. Активные центры каталазы и иммуноглобулина остаются свободными, что проявляется в их специфическом действии - связывании антигенов (антисыворотки) и разложении перекиси водорода (отсутствие окрашивания с молибдатом аммония).

Положительный эффект достигается за счет увеличения активности фермента каталазы вследствие иммобилизации ее (с иммуноглобулином и полистиролом), а также устойчивости фермента и вследствие этого возможности использования ее для многократного употребления.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: способ обеспечивает увеличение активности фермента каталазы вследствие иммобилизации ее с иммуноглобулином и полистиролом, а также устойчивости фермента и вследствие этого возможности использования ее для многократного употребления. 5 табл.

ИММОБИЛИЗОВАННАЯ КАТАЛАЗА общей формулы
K-N=-R-=N-Jg,,
где K - остаток каталазы;
Jg - остаток иммуноглобулина в качестве сорбента для улучшения физико-химических свойств препаратов крови от активированных форм кислорода;
R - остаток глутарового альдегида.