Способ выделения олигонуклеотидов Советский патент 1976 года по МПК C07H21/02 

Известен способ выделения олигон клеотидов из рибонуклеазного гидролизата РНК путем его двухступенчатого сорбирования на колонках с анионитом, элюирования на первой ступени солевым раствором, а на второй - муравьиной кислотой и формиатом аммония с последующим концентрированием одним из известных способов, например лиофи Ливадией.

Цель изобретения - упростить способ, повысить чистоту и выход олигонуклеотидов. Достигается это тем, что по предложенному способу первую ступень элюирования осуществляют при повышенной температуре, преимущественно 50-90°С. Сорбцию на первой ступени проводят на анионите Эктеол-целлюлозе, а на второй - на АН-17. Элюцию на первой ступени осзшдествляют ступенчато водносолевым раствором.

Способ выделения олигонуклеотидов заключается в следующем.

Рибонуклеазный гидролизах РНК, содержащий смесь моно- и олигонуклеотидов, сорбируют на анионите, например Эктеол-целлюлозе, и элюируют водным солевым раствором при повыщенной температуре, преимущественно, 50-90°С.

ките, например АВ-17 или Дауэкс, и элюируют олигонуклеотиды муравьиной кислотой и смесью ее с формиатом аммония.

Выделение мононуклеотидов проводят аналогично, но ЭЛЮЦИЮ на второй ступени проводят одним из известных способов, например уксусной кислотой. Полученные фракции чистых мононуклеотидов концентрируют упариванием в вакууме, а олигонуклеотидов - лиофилиэацией. Готовые продукты являются гомогенными хроматографическими веществами.

Пример. 10 г РНК растворяютв 500мл 0,02м трис - ацетатного буфера (рН-7,0-7,5 ). К полученному раствору добавляют 10 мл рибонуклеозы, 1 мл хлороформа и инкубируют в течение 24 час при 37°С.

По окончании гидролиза рибонуклеазу удаляют путем обработки гидролизата КМ-целлюлозой и сорбируют на колонке с Эктеол-целлюлозой (0,4-0,7 мгэкв/г), снабженной рубашкой для обогрева.

Сорбцию проводят из расчета 10 г исходной РНК на 3,0 л анионита (во влажном виде).

последовательно концентрациями 0,04; 0,08; 0,12 и 0,17 М со скоростью 60 мл . Полученные фракции моно-, да-, тринуклеотидов вновь сорбируют на колонках с анионитом АВ-17 (200-400 меш элюируют кипяченой дистиллированной водой в количестве, равном тройному объему колонки.

Мононуклеотиды элюируют ступенчато: 0,8 М уксусной кислотой - 3 -цитидиловую, бМ уксусной кислотой - З -урИДИЛОВЗТО кислоту.

Динуклеотиды элюируют в линейном градиенте муравьиной кислоты от О до 6 М или ступенчато в этом же интервале.

Тринуклеотиды элюируют аналогично динуклеотидам и дополнительно 0,8 М раствором формиата аммония в 4 М муравьиной кислоте. Элюцию проводят со скоростью 18-20 мл .

Мононуклеотиды упаривают в вакууме при температуре 30-40 С, а олигонуклеотиды лиофилизируют.

В случае необходимости олигонуклеотиды переводят в натриевые и другие соли нейтрализацией щелочью до рН 7,0-7,5 и лиофилизируют.

Фракции высших олигонуклеотидов элюируют 2 М ацетатом аммония, упаривают и гидролизуют

щелочью или фосфодиэстеразой и выделяют хроматографией уксусной кислотой на анионите АВ-17.

Формула изобретения

1.Способ вьщеления олигонуклеотидов из рибонуклеазного гидролизата РНК путем его двухступенчатой сорбции на колонках с анионитом, элюирования на первой ступени солевым раствором, а на второй -муравьиной кислотой и формиатом аммония с последующим концентрированием одним из известных способов, например лиофилизацией, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения чистоты и выхода олигонуклеотидов, первую ступень элюирования осуществляют при повышенной температуре, преимущественно равной 50-90°С.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что сорбцию на первой ст)шени осуществляют на анионите Эктеол-целлюлозе, а на второй - на АВ-17.

3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что ЭЛЮЦИЮ на первой ступени проводят ступенчато водносолевым раствором.