Способ выделения и очистки внеклеточной гуанилрибонуклеазы ТRIсноDеRма наRZIаNUм Советский патент 1988 года по МПК C12N9/22 C12N9/22 C12R1/885 

Изобретение относится к микробиологической промьпапенности, в частности к способу выделения гуанилрибо- нуклеазы (рибокуклеат-3 -гуанилоолн- гонуклеотид-гидролазы, К,0,3.1,27.3) применяемой в молекулярной биологии при изучении .структуры РНК для получения нуклеозид-2 ,3 -циклофосфатов, а также при ферментативном синтезе олигорибонуклеотидов с заданной последовательностью нуклеотидов.

Изобретение заключается в том, что фильтрат культуральной жи/ кости,, полученной в результате выращивания Trichoderma harzianum 01 на комплексной питательной среде., хроматографи- .руют непосредственно на КМ-целлнхпозе при этом сорбцию осуществляют в статике или динамике, а элгоцию - в динамике градиентом ацетата натрия или ацетата аммония, и-ии хлористого ыат- рия в буфере, после чего активные фракции подвергают дисшизу против буфера, пропускают через ДЭАЭ-целлюло- зу и хроматографируют на КМ-целлю- лозе.

Предлагаемый способ заключается в следующем,

Культуральную жидкость, полученную после выращивания на комплексной питательной среде гриба Trichoderma harzianum 01, фильтруют через бумагу на вакуум-фильтре. При сорбции в динамике пропускают через колонку с КМ- целлюлозой со скоростью 100-500 мл/ч При сорбции в статике в фильтрат культуральной жидкости вносят 1/10 влажного веса КМ-целлюлозы (вес на объем), перемешивают, фильтруют и сорбент переносягт Б; колонку. Основная масса сопутствуюЕцих белков и пигментов не сорбируется на КМ-целлкшо- зе. За счет этого достигается очистка в 100-500 раз. После промывки колонки фермент элюируют ацетатом натрия или ацетатом аммония, или солью в буфере, Выход по активности достигает 70%, Активные фракции диа- лизуют против трйс-НС1 буфера и пропускают через колонку с ДЭАЭ-целлю- лозой. Рибонуклеаза проходит через колонку, не сорбируясь, а часть сопутствующих белков и пигментов связывается сорбентом. При этом достигается 8-1 5-кратная.очистка с 100%-ным выходом по активности. Далее рибонуклеазу хроматографируют на КМ--целлюлозе в том же буфере. Для

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

элюции используют ступенчатый или прямолинейный градиент хлористого натрия в буфере или последовательно два градиента.

В результате получают гуанилрибо- нуклеазу с изоэлектрической точкой около 9,5, активностью 2500- 4500 ед/ в известных единицах, выходом 48-57%, степенью очистки в пределах от 6000 до 8000 раз.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 11,0л культуральной жидкости Тг. harzianum 01 фильтруют через бумажньй фильтр на вакуум-фильтре и фильтрат с активностью 14,5 ед/кл подкисляют до рН 5,1- 5,3 2Мсоляной кислотой и вносят в колонку с КМ-целлюлозой, предварительно уравновешенной 0,01 М ацетат- но-аммиачным буфером рН 5,4, со скоростью 500 мл/ч. Затем колонку промывают 0,01 М ацетатно-аммиачным буфером рН 5,3 и элюируют фермент прямолинейным градиентом буфера (0,01- 0,5 М) того же рН со скоростью 160 мл/ч. Активные фракции концентрируют ультрафильтрацией через мембрану УМ-2 и диализуют против 0,01 М трис-НС1 буфера рН 7,7. Затем раствор фермента вносят в колонку с ДЭАЭ- целлюлозой (4x16 см), уравновешенную тем же буфером, со скоростью 100 мп/ч и промывают 100 .мп исходного буфера. Вся активность фермента находится во фракциях, выходящих из колонки. После подкисления до рН 5,0 0,5 М уксусной кислотой раствор фермента, вносят со скоростью 60 МП/ч в колонку с КМ-целлюлозой (2x7 см), уравновешенной 0,01 М ацетатно-аммиачным буфером, рН 5,4. Фермент эл юируют 0,5 М ацетатно-аммиачным буфером того же рН. Получают 7 мл раствора фермента с удельной активностью 2860 степенью очистки в 6000 раз с выходом по активности 50%.

Пример 2, 27л фильтрата культуральной жидкости с активностью 15 ед/мл, полученного в результате выращивания гриба Тг, harzianum 01, после подкисления до рН 5,5-6,0 2 М соляной кислотой вносят в 4 парал- лельные колонки с КМ-целлюлозой (3 колонки 6,8x30 см и одна 7,7х хЗО см). Перед сорбцией колонки уравновешивают 0,01 М ацетатнььм буфером рН 5,5. Затем колонки промывают ис

ходным буфером и элюируют фермент последовательно ступенчатым градиентом 0,2 и 0,5 М ацетата натрия рН 7,4 Активные фракции концентрируют ультрафильтрацией через мембрану УМ-2, концентрат диализуют против 0,01 М трис-НС буфера рН 7,3 и пропускают через колонку с ДЭАЭ-целлкшозой (6x12,5 см), уравновешенной этим же буфером. Затем раствор фермента вносят в колонку с КМ-целлюлозой (4x10 см), уравновешенной 0,02 М трис-НС1 буфером, рН 7,3. Элюируют рибонуклеазу прямолинейным градиентом хлористого натрия (0-0,5 М) в 0,02 М трис-НС1 рН 7,3 со скоростью 85 мл/ч. Получают 140 мл раствора фермента с удельной активностью 32000 ед/А2рр 1, степенью очистки в 8000 раз и выходом по активности 57% Пример 3. К 15,7л фильтрата культуральной жидкости Тг. harzianum 01 с активностью 30 ед/мл после под- кисления до рН 5,0 2 М соляной кисло той для сорбции в статических условиях прибавляют 0,75 кг влажной КМ- целлюлозы, предварительно уравновешенной 0,01 М ацетатным буфером, рН 5,1, перемешивают 30 мин при комнатной температуре и отделяют сорбент фильтрованием на вакуум-фильтре. К полученному таким образом фильтрату прибавляют еще 0,75 кг влажной КМ- целлюлозы, перемешивают 30 мин и фильтруют. Обе порции сорбента взмучивают в 0,01 М ацетатном буфере рН 5,1 и вносят в колонку (7,8x60 см). Далее сорбент промывают 5 л буфера и элюируют фермент 0,25 М трис-НС1 буфером рН 7,3, содержащим 1 М хлористого натрия. Раствор фермента диа лизуют против 0,01 М трис-НС1 буфера рН 7,3 и пропускают через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (4x17 см) со скоростью 500 мл/ч. Затем проводят хроматографию на КМ-целлюлозе в колонке (1,8x7,6 см). Элюцию осуществляют двумя градиентами со скоростью 70 мл/ч. Вначале используют прямолинейный градиент буфера (0,01-0,05 М, объем сосудов 150 мл), а затем градиент хлористого натрия (0,0-0,2 М) в 0,05 М трис-НС1 буфере рН 7,3. Фермент элюируют 0,1 М раствором хлористого натрия. Получают 33 мп раствора фермента с удельной активностью

10

15

20

, 25 392093

4500 ед/А

30

35

40

45

50

ио

1 И ВЫХОДОМ по активнос55

ти 54%.

В таблице приведены результаты очистки, описанные в примерах 1-3, а также еще двух очисток (опыты 5,6), в которых использовались иные вия, и результаты оказались значительно хуже.

Преиг-1ущество предлагаемого способа заключается в получении достаточно простым методом гуанилрибонуклеазы со щелочныьш свойства 1и высокой удельной активности от 2860 до 4500 ед/мл и выходом от 48 до 54%, включающем всего три этапа, очистки, причем первый этап очистки при использовании сорбции в статике значительно сокращается, а хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе сводится к простой фильтрации путем пропускания раствора фермента через соответствующую колонку.

Гуанилрибонуклеаза, являющаяся щелочным белком, в отличие от РНК- азы С 7 легко отделяется от кислых продуктов ее действия сорбцией на ка- тионитах и легче иммобилизуется традиционными способами.

Формула изобретения

Способ выделения и очистки внеклеточной гуанилрибонуклеазы Tricho- derma harzianum 01, заключающийс я в хроматографии фильтрата культуральной жидкости на КМ-целлюлозе при рН 5,0-7,3, сорбции фермента в статике или динамике и элюции фермента с КМ- целлкшозы ступенчатым градиентом 0,2-0,5 М ацетата натрия или 0,25 М трис-НС1 с 1,0 М хлористым натрием, или градиентом 0,01-0,5 М ацетатно- аммиачного буфера, полученные активные фракции подвергают диализу против 0,01-0,02 М трис-НС буфера с рН 7,3- 7,7 и очистке на ДЭАЭ-целлкшозе в том же буфере, с последующей хроматографией на КМ-целлюлозе, при этом для элюции используют 0,5 М ацетатно- аммиачный буфер или линейный градиент 0,01-0,5 М хлористого натрия в 0,02 М трис-НС буфере, или последовательно два градиента: вн ачале линейный градиент трис-НС 0,01-0,05 М, а затем линейный градиент хлористого натрия 0,01-0,2 М в трис-НС буфере.

HtMHpwouTb

jGpM-j l Г рЗШ

c Vi:

oCJ S 3 Pli

0,,-010,01 .0,,04 0,010,0 Зтеоция

Пг иг«ши Ступе -Ступен-Ступая- Прянолй Сч-упе - 1ейиб й чэтыйчатыйчитки нейньйчатый

0,0(--0,5 И0,2 к 0,5ИО,25т1)Ие-О О -,0,5

ячет-амг..ацетата НаНГЛ и JИ фосф,й,осф,

5,37,4-7,6RaCl 6,56,9

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности, в частности к способу выделения гуанил- рибонуклеазы, применяется в молекулярной биологии для изучения структуры РНК и ферментативном синтезе оли- горкбонуклеотидов Сущность изобретения заключается в том, что фильтрат культуральной жидкости Tricho- derma harzianum хроматографируют непосредственно на КМ-целлю,гюзе при рН 5,0-7,3, при этом сорбцию осуществляют в статике или динамике, а элюцию в динамике ступенчатым градиентом 0,2 и 0,5 М ацетата натрия рН 7,3 или 0,25 М трис-НС с 1,0 М NaCl, или прямолинейным градиентом 0,01- 0,5 М ацетатно-аммиачного буфера рН 5,3, после чего активные фракции подвергают диализу против О,01-0,02М трис-НС1 буфера рН 7,3-7,7, пропускают через ДЭАЭ-целлюлозу в тпм же буфере и окончательно хроматографируют на КМ-целлюлозе, при этом для элюции используют ацетатно-ам миачный буфер рН 5,4 или прямолинейный градиент 0,01-0,5 М хлористого натрия в 0,02 М трис-НС1 буфере, или последовательно два градиента: вначале прямолинейный градиент 0,01-0,05 М трис- НС буфера рН 7,3, а затем градиент 0,2 М хлористого натрия в трис-НС1 буфере того же рН. Предложенньй способ позволяет получить гуанилрибо- нуклеазу со щелочными свойствами с выходом 48-54% и удельной активностью 2860-4500 ед/мл, которая в отличие от РНКазы С,; легко отделяется от кислых продуктов ее действия сорбцией на катионитах и легче иммобилизуется трад}П1Ионными способами. 1 табл. С ГС С© оо

,77.3 7,3

ч-рнс- ЙС

0,0(0,010,03

Траткй яроматография на КМ цаляю Гозе

5,4

Сорбция 7,37,3

АцетгИ НО- трнс-НС

аммиячныЯ

0,,010,02

Зпюция

Ступен- Прймолн- чатнйаейниЧ

7,3

0,03

7,3

0,02

,56,9

®осфат й5а 0,02О,Of0(,0

7,36,56,9

Фосфатной 0,0)0,0)0,0)

Прянолн- Ступен- яейныйчатьйЗ