СПОСОБ ОЧИСТКИ ФЛАВИНАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДА Российский патент 1995 года по МПК C07H19/16 

Изобретение относится к органической химии, а именно к улучшенному способу очистки флавинадениндинуклеотида (ФАД).

ФАД является одной из коферментных форм витамина В₂. В качестве кофермента он входит в состав большинства флавопротеидов, непосредственно участвующих в тканевом дыхании, окислительном фосфорилировании и др. процессах в организме. В медицинской практике ФАД (флавинат) применяют при лечении: глаукомы и дистрофических процессов в сетчатке глаза; кожных заболеваний типа псориаз, себорея; наследственных гемолитических анемий.

Изобретение может быть использовано в химии биологически активных соединений, в фармацевтической промышленности.

Известны способы очистки флавинадениндинуклеотида с помощью адсорбционной хроматографии на активированном угле, фулеровой земле, флоризиле [1-3]
Однако эти методы позволяют четко отделить только рибофлавин. Очищенный ФАД содержит примеси рибофлавинмонофосфата (РМФ) и цикло-РМФ. Чистота выделенного флавината не превышает 85%
Недостатками этого метода являются использование большого объема сорбента на единицу технического ФАД (1 г на 8,5 л), трудность масштабирования производства. Кроме того, сефадекс представляет собой декстрановый гель, который подвержен микробному заражению, а это резко ухудшает процесс очистки.

Известны способы ионообменной очистки технического ФАД [4-8] При очистке на фенольном катионите Duolite С-10 выделен ФАД с содержанием 87% [4] При использовании комбинации катионита Amberlite IR-120 и анионита Amberlite CG-400 [5] выделяют ФАД с содержанием 85%
Описан способ очистки ФАД на катионите Dowex AG-50 [6] но он может использоваться только в лабораторных условиях, т.к. удерживание рибофлавина на сорбенте очень велико и для регенерации его требуется чрезвычайно большой объем растворителей. Это делает его неприемлемым для промышленного использования.

Описан способ очистки ФАД на высокоосновных анионообменных сорбентах Dowex 1x2 и Amberlite IRA-411 [7] В ходе этой очистки выделяют ФАД достаточно высокой степени чистоты 98%
Недостатком этого способа является то, что ФАД выделяют в виде Са-соли, в то время, как в медицине используется только ди-Са-форма ФАД. Кроме того, для хроматографии используется продукт, прошедший предварительную очистку и содержащий 82% ФАД.

По технической сущности наиболее близким к описываемому является способ очистки ФАД с использованием низкоосновного и высокоосновного анионитов, который реализуется следующим образом [8]
Раствор технического ФАД пропускают через высокоосновной анионит Dowex 1х1 в Сl^- форме. Сорбент промывают водой, затем 20%-ным раствором NaCl элюируют ФАД. Солевой элюат ФАД экстрагируют фенолом, к фенольному раствору добавляют изопропиловый эфир и затем переводят обессоленный ФАД в воду. Водный раствор ФАД пропускают через колонку с низкоосновным анионитом ДЕАЕ-сефадексом. Сорбент промывают водой, затем десорбируют очищенный ФАД 2%-ным раствором NaCl. Раствор концентрируют в вакууме и повторяют стадию фенольной обработки для обессоливания раствора ФАД. Водный раствор осаждают этиловым спиртом, получают ФАД с чистотой 88-90%
Основными недостатками этого способа являются следующие.

Очистка сложна технологические и осуществляется в 5 стадий: хроматография на высокоосновном анионите, обессоливание, хроматография на низкоосновном анионите, обессоливание, выделение из водного раствора.

Достигнутая степень чистоты 80-90% является недостаточной для применения в медицине.

Целью изобретения является упрощение технологии очистки флавината и повышение чистоты целевого продукта.

Поставленная цель достигается способом хроматографической очистки ФАД, включающим комбинацию двух сорбентов, отличительными признаками которого являются: первоначальное хроматографирование на сфероне ДЕАЕ 1000 в Сl^- форме, который промывают последовательно ацетатным буферным раствором в сочетании с NaCl с ионной силой 0,05-0,5 М с рН 3-5, и водным раствором NaCl 0,1-0,5 М, при соотношении технического ФАД к сорбенту 1,2-1,5 г на 100 л. Полученный раствор флавинадениндинуклеотида адсорбируют на полисорбе "С", отмывают водой от хлористого натра и десорбируют целевой продукт водно-спиртовым раствором. Соотношение технического ФАД к полисорбу составляет 1,7-2,0 г на 100 мл, ФАД из раствора выделяют этанолом.

Анализ известных решений показал, что отличительные признаки, в частности комбинация сорбентов сферон ДЕАЕ 1000 с полисорбом "С", не были описаны ранее для выделения и очистки флавината.

Большое значение для тонкого процесса очистки технического ФАД от ряда родственных соединений имеет не только выбор сорбентов, но и подбор системы элюентов, их ионной силы, значение рН, соотношение объема сорбента и количества нанесенного вещества.

При снижении ионной силы ацетатного буферного раствора ниже 0,05 М происходит увеличение объема элюатов на всех этапах хроматографии на сфероне и, в частности, увеличение объема фракции флавината. При повышении ионной силы буферного раствора выше 0,5 М объем фракций уменьшается, но одновременно происходит смешение зоны ФАД с зонами сопутствующих примесей.

Уменьшение рН буферного раствора до значений ниже 3,0 приводит к частичному расщеплению ФАД до составляющих его мононуклеотидов. Повышение значений рН буферного раствора выше 5,0 ухудшает разделительную способность сорбента, увеличивает объем элюата и снижает чистоту целевого продукта.

Элюция фракций чистого флавината проводится раствором 0,1-0,5 М хлористого натрия. При этом снижение концентрации NaCl ниже 0,1 М резко увеличивает объем фракций ФАД, увеличение концентрации NaCl выше 0,5 М приводит к смешению фракции чистого флавината с примесями, находящимися выше него на сорбенте, что совершенно недопустимо.

Элюция ФАД с полисорба проводят водно-спиртовым раствором, что позволяет провести одновременно и концентрирование элюата ФАД. При элюции флавината водой увеличивается объем элюата и время процесса.

Сущность предлагаемого способа хроматографической очистки технического ФАД состоит в следующем.

Водный раствор технического ФАД сорбируют на колонке с низкоосновным метилметакрилатным анионитом сферон ДЕАЕ 1000. Примеси десорбируют буферным раствором, содержащим NaCl и СН₃СО₂Na с ионной силой 0,05-0,5 М и рН 3-5. Флавинат десорбируют раствором NaCl с ионной силой 0,1-0,5 М. Элюат обессоливают и одновременно концентрируют в 10-20 раз на макропористом сополимере стирола и дивинилбензола полисорбе "С". Кристаллический ФАД выделяют осаждением этиловым спиртом из водного раствора.

Очистка флавината описываемым способом иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. 6 г технического ФАД с содержанием основного вещества 50% растворяют в 20 мл дистиллированной воды. Раствор наносят на колонку с 450 мл сферона ДЕАЕ 1000 в Сl^- форме. Сначала элюцию проводят буферным раствором ацетата натрия и хлористого натрия с ионной силой 0,2 М и рН 4,2. При этом элюируют примеси аденозинмонофосфата, рибофлавина, рибофлавинмонофосфата, цикло-рибофлавинмонофосфата. Затем проводят десорбцию ФАД 0,2 М водным раствором хлористого натрия. Контроль за ходом хроматографии осуществляют методом БХ и ВЭЖХ.

Фракции, содержащие чистый ФАД, объединяют (≈ 3000 мл) и направляют на обессоливание на колонку с полисорбом "С". Сорбцию раствора ведут со скоростью 1,5 л/ч. По окончании сорбции сорбент промывают водой от NaCl и десорбируют ФАД водным этиловым спиртом в объеме 230 мл.

Элюат флавината упаривают в вакууме до объема ≈ 20 мл и осаждают этиловым спиртом. Получают желто-оранжевый кристаллический порошок ФАД с содержанием 99,5% выход 77,2%
Использование способа позволяет упростить технологию очистки технического флавината, т.к. отпадает необходимость в двух операциях обессоливания методом фенольной экстракции.

Очищенный флавинат получают более высокого содержания (98-99,5%). Используемые сорбенты не подвержены микробному заражению. Способ поддается промышленному масштабированию. Данные приведены в таблице.

Использование: в качестве фармпрепарата при лечении глаукомы, псориаза, себореи, наследственных гемолитических анемий. Сущность изобретения: продукт флавинадениндинуклеотид (ФАД). Выход 77,2% Содержание основного вещества 99,5% Реагент 1: ФАД Реагент 2: диэтиламиноэтил сферон в Cl^- форме с йонной силой 0,05 0,5 М и pH 3 5 и полисорб С. Условия реакции: пропускают водный раствор ФАД через колонку с адсорбентами. Примеси десорбируют буфером, содержащим NaCl и CH₃CO₂Na ФАД десорбируют NaCl с йонной силой 0,1 0,5 М, элюат обессоливают и концентрируют в 10 20 раз на "полисорбе С". Кристаллический ФАД выделяют осаждением этиловым спиртом. 1 табл.

СПОСОБ ОЧИСТКИ ФЛАВИНАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДА (ФАД) путем последовательного хроматографирования на двух различных сорбентах, включающих анионит, с последующим элюированием и десорбцией с использованием водного раствора хлористого натрия, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения чистоты целевого продукта, технический ФАД хроматографируют на диэтиламиноэтил (ДЕАЕ) сфероне в Ce -- форме в качестве анионита, последовательно элюируют ацетатным буферным раствором в сочетании с хлористым натрием с йонной силой 0,05 0,5 моль при рН 3 5 с последующей десорбцией ФАД водным хлористым натрием 0,1 0,5 моль при соотношении технический ФАД (г) ДЕАЕ сферон (мл) 1,2 1,5 100, затем солевой раствор ФАД хроматографируют на полисорбе С при соотношении технический ФАД (г) полисорб С (мл) 1,7 2,0 100 с последующей десорбцией водным спиртом и выделением целевого продукта.