Способ получения @ - и @ -субъединиц из лютенизирующего гормона Советский патент 1987 года по МПК C07K14/59 

11

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения Qi- и -субъединиц из лютенизирующего гормона и может найти применение в биологии, медицине, фармацевтической гфомьпиленности.

Цель изобретения - упрощение процесса и повышение выхода целевого продукта.

Предлагаемый способ благодаря использованию в качестве сорбирующей насадки сефадекса G-25 и ступенчатого градиента при элюции вначале системой н-бутанол - вода - уксусная кислота, в объемных процентах 50-60; :25-30:15-20 для вымывания р-субъединиц, а затем системой н-бутанол - вода - уксусная кислота; в объемных процентах 0-35:50-65:13-35 для вымывания об -субъединиц, позволяет повысить выход целевых продуктов до 96%, вместо 75% в известном способе, а таклсе упростить процесс, сократив количество стадий (обессоливание и гель-фильтрацию) и исключив использование мочевины или гуанидинхлори- да, которые к тому же содержат примеси, снижающие биологическую активность белка,

.Пример 1. 500 мг ЛГ кашалота растворяют в 50 мл системы, содержащей н-бутанол, воду и уксусную кислоту в объемном соотношении 10:5:3j в об.% 50-60:25-30:15-20. Раствор белка вносят в колонку с сефадексом G-25 тонкий (3,6-25 см), уравновешенную той же системой (нагрузка 1-2 мг белка на 1 мл), скорость элюции 10- 20.МГ/СМ ч. После выхода первого пика, содержа1цего /3-субъединицу колон- ку отмывают до исчезновения белка в элюате и дальнейшую глюцию проводят системой с объемным соотношением компонентов н-бутанол - вода - уксусная кислота 2:4:1, в об.% 0-35:50-65:15- 35, Скорость элюции 120 мл/ч. Первый и второй пики собирают раздельно и упаривают на роторном испарителе в при 35 С до 1/10 исходного

объема. Полученные фракции разбавляют водой и лиофилизируют. Материаль .второго пика подвергают гельфильт- рации на колонке с сефадексом G-100 в 0,05 М аммоний бикарбонатном буфере. Б результате гельфильтрации получают два. пика. Первый пик - белковые примеси (не ЛГ), второй пик содержит ci -субъединицу. Фракции объединяют и лиофнлизируют. Выход/3-субъ

s

0

0

04032

единицы 240 мг, c«L-субъединицы 220 мг, примесные белки 20 мг. Таким образом, выход субъеднниц с учетом примесей 96%.

5 Пример2. 500 мг ЛГ минке обрабатывают аналогично примеру 1. В1тход -субъединиць ЛГ 215 мг, и - субъединицы ЛГ 220 мг и примесные белки 21 мг (87%).

П р и м е р 3. 100 мг ЛГ быка обрабатывают, как в примере 1, кроме следующих изм:ерений: белок растворяют в 12 мл ш ходной трехкомпонентной системы н-бутанол - вода - уксусная кислота 10:5:3. Размер колонки с сефадексом G-25 (2,515 см). Выходоб-, субъединицы 42 мг,/3-субъединицы

5

9

43 мг, примесные белки 6 мг.

П р и м е р 4. 50 мг ЛГ кашалота растворяют в 25 мл системы н-бутанол- вода - уксусная кислота 13:4:4 и про- 1тускают через колонку с сефадексом G-25 объемом 50 мл. Вторая система элюции и прочие условия аналогичны npi-шеру 1. Выход |5-субъединииы 15 мг,, к.-субъединиЩ)1 18 мг.

Пример5. 50 мг ЛГ кашалота растворяют в 5 мл системы н-бутанол - вода уксусная кислота 10:5:3 и пропускают через колонку с сефадексом G-25 объемом 30 мл,и -Субъединицу де сорбируют системой с соотношением компонентов н-бутанол - вода - уксус- ная кислота 3:3:2. Остальные условия 5 подобны примеру 1„ Выход (Л-субъединицы 13 мг, 3-субъединицы 22 мг.

Замена сефадекса в качестве сорбента на целлюлозу приводит к уменьшению отношения белок/объем сорбента, а таклче к замедлению процесса из- за большего сопротивления току эяюен- та колонок с целлюлозой.

П р и м е р 6. Для разделения 100 мл ЛГ кашалота на субъединицы 5 используют колонку с целлюлозой (3,6 25 см)5 скорость элюции 30 мл/ч, при прочих условиях одинаковых с примером 1. Выход ь:.-субъединицы 35 мг, ;3-субъеднницы 38 мг.

50 .

Критерием частоты полученных препаратов oi- и 3-субъединиц является изс аминокислотный состав. В таблице приведены данные ло аминокислотному

55 составу Л- и р-субъединиц ЛГ из гипофизов быка и кита кашалота, полученные при опреде.пении аминокислотного состава и аминокислотной последовательности.

Из таблицы видно, что аминокислот ньш состав субъединиц, полученных предлагаемым и известным способами, практически совпадает.

Предлагаемьй в данном способе ин- тервал нагрузок по белку обусловлен следующим. Увеличение (2, мг/мл) соотношения белок/сорбент будет приводить к проскоку об-субъединицы во фракцию -субъединицы. Чрезмерное умень- шени е (1 мг/мл) соотношения белок/со бент приведет к замедлению процесса и увеличению объема фракций, в которые входят fti- и 8-субъединицы.

Процесс элюирования фракций об- и В субъединиц контролируют с помощью УФ детектора при 280 нм, объем элюи- рованных фракций oi - и -субъединиц не превышает обычно удвоенного объема нанесения.

Поскольку сёфадексы - сорбенты не приспособленные к работе с противодавлением, то обычно используется естественная текучесть колонки с се- фадексом. Р скусственное заг-шдление процесса элюции приводит к уменьшению объема фракций злюирующихся oi- и р-субъединиц до 1,3 - 1,5 объема нанесения, но одновременно увеличивается время разделения. Естествен- ная текучесть колонки длиной 20 см, заполненной сефадексом G-25 (тонкий)

пределах 10-20 мл/см ч. Для элюирования используют систе

мы растворителей из н-бутанола - воды - уксусной кислоты. Для первой системы с интервалом для н-бутанола 50-60%, для воды 25-30%, а для ук- сусной кислоты 15-20%. Снижение для этой системы содержания бутанола до 50% и ниже, а также увеличение содержания уксусной кислоты до 20% и вьше приводит в целом к уменьшению сорбционных свойств сефадекса по от- ношению к -субъединнце. Это влечет за собой снижение нагрузочной емкос- ти колонки с сефадексом, а еще большее снижение концентрации бутанола или (и) увеличения концентрации ук- сусной кислоты приводит в конце концов к проскоку oi-субъединицы во фракцию А-субъединицы. Снижение (в первой системе) содержания воды до 15% и ниже приводит к снижению растворимое ти белка в первой системе, а увеличение содержания воды до 20% и вьш1е влечет за собой увеличение содержания уксусной кислоты (обусловлено

O

5 0

5 0

5

Q г

условием смешиваемости системы) и как следствие к увеличению вероятности проскока (Х. -субъединицы во фракцию -субъединицы.

Состав второй системы допускает большие вариации содержания компонентов. Основные требования предъявляемые к ней: хорошая растворимость в ней(1/-субъединицы, хорошая смешива- емость с первой системой и отсутствие сорбционных взаимодействий между сефадексом иoi-субъединицей в зтой системе.

Снижение во второй системе содержания н-бутанола вплоть до 0% влечет увеличение содержания уксусной кислоты до 35%. В целом смешиваемость первой и второй систем лучше, когда обе системы содержат н-бутанол, кроме того позьш1ение содержания уксусной кислоты - это более жесткие нежелательные условия для белка. Содержание воды во второй системе целиком определяется приведенными вьште тремя требованиями.

Формула изобретения.

1. Способ получения - и ,в -субъединиц из лютенизирующего гормона, включаюш;ий пропускание раствора лютенизирующего гормона в смеси растворителей через колонку с сорбирующей насадкой, элюирование растворителем переменного состава, последующее упаривание, лиофилизацию и гель- фильтрацию на сефадексе G-100 фракции, содержащей сб-субъединицу, о т- личающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повьш1ения выхода, в качестве сорбирующей на- садки используют сефадекс G-25, в качестве растворителя - смесь н-бутанол - вода - уксусная кислота при соотношении, об.: 50-60:25-30:15-20 при загрузке гормона из расчета 1- 2 мг на 2 мл сорбента, а элюирование проводят ступенчато с использованием вначале указанной смеет- растворителей до полного вымывания Б-субъединицы, затем элюирование проводят смесью н-бутанол - вода - уксусная кислота при соотношении 0-35:50-65:15- -35, об.%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что состав элюента первой ступени н-бутанол - вода - уксусная кислота 10:5:3, об.%.

3. Способ по П.1, о т,л Ц и и с я тем, что состав

1310-51336

и ч а ю - второй ступени н-бутанол - вода - yKn элюента

сусная кислота 2:4:1, об.%.

Аминокислотный состав субъединиц, полученных известными методами.

А

Аминокислотньш состав субъединиц„ полученных предлагаемым методом.

Редактор И.Сегляник

Составитель В.Волкова

Техред н.Глущенко Корректор И.Эрдейи

Заказ 1865/24Тираж 348 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород,ул.Проектная,4

второй ступени н-бутанол - в

сусная кислота 2:4:1, об.%.

Изобретение касается получения природных веществ, в частности об и р-субъединиц (СЕ) из лютенизирующего гормона, которые используют в биологии, медицине и фармацевтической промьшшенности. Цель - повьшение выхода СЕ и упрощение процесса. Последний ведут пропусканием раствора лютенизирующего гормона из кашалота или быка в другой смеси растворителей при объемном соотношении н-бутанола, воды и СН,СООН (50-60):(25-30):(15- 20) через колонку с сорбирующей насадкой, в качестве которой используют сефадекс С-25 при загрузке гормона 1-2 мг на 1 мл сорбента. Элюиро- вание проводят ступенчато, т.е. вы- мьшают -субъединицу указанной смесью растворителей (лучше при объемном соотношении 10:5:3), а затем oi-субъединицу, но с другим соотношением растворителей, т.е. (0-35);(50-65):(15- 35), преимущественно 2:4:1. Затем полученные растворы упаривают, лиофили- зируют и проводят гельфильтрацию на сефадексе G-100 фракции, содержащей oi -субъединицу. Способ обеспечивает увеличение выхода с 75 до 96% и позволяет упростить процесс за счет сокращения стадий обессоливания и гельфильтрации при исключении использования мочевины и гуанидинхло- рида, которые содержат примеси, снижающие биологическую ценность белков. 2 з.п. ф-лы, 1 табл. & (Л io 4 о со