СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ Советский патент 1969 года по МПК C07K1/10 

Известен способ получения лептидов на сшитом полистироле, несущем гидроксильные группы.

После снятия защиты с аминогруппы в случае синтеза пептидов на полимере присоединение следующих аминокислот достигается с помощью методов смешанных ангидридов, карбодиимидов и активировавных эфиров. Снятие полученных пептидов достигается омылением сложноафирной связи или действием бромистого водорода. Недостатками известных до сих пор способов синтеза лелтидов на полимере является то, что, во-юервых, такие полимерНые носители необходимо специально готовить, во-вторых, ограниченная проницаемость сщитых полистиролов с .ростом длины синтезируемого пептида приводит к пропускам в цепи синтезируемого пептида и, в-третьих, емкость этих носителей не удается поднять выше 0,5-0,7 мг-экв1г, с целью устранения указанных недостатков в предлагаемом способе иопользуются легкодоступные гидроксилсодержащие полимеры, а именно сшитые де.кстраны - липофильные сефадексы марки и сефадексы марки G, предварительно модифицированные.

НИИ до 90°С в инертном растворителе в присутствии основания.

Присоединяют первую кислоту нагреванием соответствующего модифицированного сефадекса G с триэтиламинной солью грег-бутилоксикарбонил ВОС-аминокислоты в инертном растворителе при 80°С в течение нескольких часов в присутствии основания. В случае использования сефадекса первую кислоту присоединяют с помощью карбонилдиимидазола яри комнатной температуре с помощью смешанных ангидридов или хлорангидридного метода с использованием им идхлоридов.

Снятие Туоег-бутилоксикарбонильной защиты (ВОС) как в случае сефадексов G, так и в случае сефадекса /Н-20 осуществляют обработкой сефадекса с присоединенной аминокислотой действием безводной трифторуксуспой кислоты. Присоединение последующих аминокислот осуществляют с помощью активированных эфиров ВОС-аминокислот.

Снятие пептидов с полимера осуществляют омылением сложноэфирной группировки при комнатной температуре с помощью 1н. NaOH, или гидразинолизом. Емкость полученных полимерных носителей определяют после присоединения первой аминокислоты по привесу или по содержанию азота. В случае применения сефадекса / Н-20 и карбонилдиимидазола емкость носителя составляет 1,5- 7,0 мг экв/г. Преимуществом новых полимерных носителей для синтеза лептидов является: 1.ВысОКая емкость полимерных носителей, значительно превышающая емкость известных. 2.Хорошая набухаемость сефадексов и .высокая лроницаемость их для молекул растворителя и реагентов, что значительно снижает вероятность пропусков в цени синтезируемого лептида. В случае синтеза тетра- и лентапептидов лолучены электфоретически однородные лелтиды. 3.Доступность полимерных носителей. Пример 1. Синтез дилептида - карбобензоксиглидил-ОЬ-аланина с использованием модифицированного сефадекса G-25. A.М о д и ф и к а ци я с е ф а д е к с а. 0,7 г сефадекса G-25 обрабатывают раствором 7,0 г хлорангидрида п-бромметилбензойной кислоты и iO мл диметилформамида (ДМФА) и 1,4 мл триэтиламина (ГЭА). Смесь греют на водяной бане лри 80-ЭО С в течение 4 час. Полимер отфильтровывают, моют ДМФА, диожсаном, водой, этанолом и эфиром, сушат над P2Cio в вакууме.. Б. Присоединение В О С - D. Lа л а н и н а. 0,85 е модифицированного сефадекса присыпают к раствору 1,2 г (.0,0063 моль) BOC-DL-ала-ОН и 0,86 мл (о.ООбЗ моль) триэтиламина в 10 мл абсолютного этилацетата. Смесь кипятят 12 час с обратным холодильником, лолимер фильтруют, 1П;ромывают (см. выше), сушат над РаОз. B.Снятие 3 а щ и т н .о и г ,р у л л ы и синтез дилелтида. 0,81 г лолученного выше сефадекса с лрисоединенньш ВОС-DL-аланином обрабатывают 20 мл безводной трифторуксусной кислоты. Через 1 час лолимер фильтруют, л.ромывают диоксаном, водой и заливают 20 мл 5 /о-ного раствора бикарбоната натрия. Через 30 мин лолимер отфильтровывают, MOfOT водой, этанолом, эфиром и заливают раствором i г оксисукцинимидного эфира карбобензоксиглицина в 5 мл диоксана и 5 Л1У1 воды. Через 12 час полимер отфильтровывают, лромьшают (см. выше) и сушат в вакууме над . Снятие пептида ic in о л и м ер а. 0,8 г сефадекса с лрисоединенньш к нему дилептидом обрабатывают 5 мл I н. NaOH. Через 1 час лолимер отфильтровывают, тщательно лромьшают водой и водные вытяжки подкисляют 5 н. соляной кислотой. Водный раствор экстрагируют этилацетатом. Экстракт сушат над сульфатом магния. По1сле отгонки растворителя леитид лерекристаллизовывают из воды. Выход карбо:бензокснглицил-ВЬ-аланина 0,116 г что соответствует емкости 0,59 мг-экв/г; т. пл. 182-183°С. Пелтид электрофоретически и хроматографически однороден. фенилаланилглицина с использованием сефадекса LH-20, 5,2 г (0,03 моль) ВОС-гли-ОП и 5,0 г (0,03 моль) карбонилдиимидазола растворяют в 20 мл ДМФА. Через 20 мин к лолученному раствору присылают 3 г сефадекса LH-20. Смесь оставляют при комнатной температуре на 20 час, полимер отфильтровывают и лромывают (см. выше). Вес сефадекса LH-20 с /присоединенным ВОС-гли равен 4,1 г. Снятие-защитной груллы с амийогруллы и присоединение других аминокислот осуществляют по обычной методике (см. выше). После обычного снятия пептида с 2,3 г сефадекса, к которому присоединен пентапептид, получают 0,9 г карбобензокси-Ь-лейцил-Ь-аланил-Ь-валил - L - фенилаланилглицина, что соответствует емкости 1,2 мг-экв/г; т. лл. 240-242° С. Пример 3. Получение тетрапептида - карбобензОКсиглицил-Ь-лейцил-Ь - лропил-L -фенилаланин с помощью сефадекса ЬП-20. Синтез пептида проводят аналогично примеЕмкость носителя после снятия тетралентида равна 1,3 мг-экв/г, т. лл. 101°С. Пептид Электрофоретически однороден. Пример 4. Получение карбобензоксиглицилгидразида с использованием сефадекса LH-20. А. Присоединение Кар бобен3 о к с и - к б 3 - г л и ц и и а :к с е |ф а д е к с у LH-20. 7,0 г кбз-гли-ОН (0,033 моль) и 5,5 г (0,033 моль) карбонилдишмидазола растворяют в 10 мл ДМФА. Через 30 мин. « этому раствору присылают 2,5 г сефадекса LH-20. Через 24 час полимер отфильтровывают и промывают (см. выше). Вес сефадекса с присоединенным карбобензоксиглицином 5,9 г, что соответствует ем-кости 7,0 мг-экв/г. Б. Снятие ,к а ip б о б е н 3 о к с иглицина с сефадексаЬН-20 с ломощью гидразина. Получение к а р б о б е н 3 о к с и г л ,и Ц и л г ,и д р а3 и д а. 2,0 г сефадекса ЬП-20 с лрисоедиенным карбобензоксиглицином заливают 8мл 50в/о-його гидразина, через 48 час отфильтровывают полимер, лромывают горячим этаноом, после отгоНки этанола получают 1,1 г идразида Карбобензоксиглицина; т. пл. 115- 116°С, что соответствует емкости ,0 мг экв/г. Предмет изобретения 1. Способ получения лептидов на полимером носителе, с присоединением первой амиокислоты к носителю известным способом, тличающийся тем, что, с целью повышения ыхода пептидов с весовой единицы носителя устранения нропусков (В цепи синтезируемых ептидов, в качестве носителя используют сеадекс марки LH или предварительно моди52.Способ 1ПО п. 1, отличающийся тем, что сефадекс мар.ки G модифицируют обработкой хлор ангидрид ом и-бромметилбензойной кислоты при «агревании до 90°С. 3.Способ 1ПО П. 1, отличающийся тем, что5 первую аминокислоту присоединяют к сефабдексу марки LH с помощью карбонилдиимидазола. 4. Способ по йп. 1 и 2, отличающийся тем, что первую аминокислоту присоединяют к сефадексу марки G длительным нагреванием до 80°С в присутствии основания.