Способ получения биоспецифического сорбента для очистки аминопептидаз Советский патент 1984 года по МПК C07F7/02 C12N9/48 

Изобретение относится к способу получения нового биоспецифического сорбента для очистки аминопептидаз может найти применение в биохимии, медицине и прикладной микробиологии. В настоящее время наиболее перспективным для избирательной очистки ферментов является метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам бустрата или ингибиторам, ковалентно связанньвл с нерастворимым носителем, что позволяет разделять ферменты на основе их биологической специфичности, а потому достигать.более высокой степени очистки по сравнению с другими видами хроматографической техники l . Известные в настоящее время биоспецифичёские сорбенты для очистки аминопептидаз представляют собой нерастворимые носители - производные целлюлозы, агарозы или метилметакрилата, к которытч ковалентно присоединен лиганд, специфичный для аминопептидаз 2 и зД . Известен сорбент для очистки ами нопептидаз который получают путем присоединения к сферону 300, соде жащему ковалентно присоединенный гексаметилендиамин, D-лейцина, с использованием в качестве койденсирующего реагента водорастворимого карбодиимида. Этот сорбент позволяе проводить выделение аминопептидаз с степенью очистки в 6,4 раза. Недостатком этого сорбента является его малая избирательность,-что не позволяет получать ферменты с высокой степенью очистки. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения биоспецифического сорбента для очистки аминопептидаз, заключаю щийся в ковалентном присоединении к п-фенилендиамин-сефарозе 4В пептидного ингибитора а1 мнопептидаз H-Thr(OBu)-Phe -Pro-OH. Известный сорбент позволяет выделять лейцинаминопептидазу из Asp. oryzae со степенью очистки в 20 раз З . Однако известный сорбент обладает низкой емкостью - 0,36 глкмоль пептида на 1 мл сефарозы, так как известный способ позволяет получать сорбент только с низким содержанием трипептидного лиганда, поскольку реакция ацилирования п-фенилендиамин-сефарозы 4В проводится с помощью водорастворимого карбодиимида с незамещенным трипептидом. Другим недостатком известного способа является использование в качестве нерастворимого носителя производного агарозы - п-фенилендиамин-сеФарозы 4В, которая легко разрушается под действием гликозидаз - ферментов, часто присутствующих в микроскопических грибах и бактериях, являющихся источником выделения аминопептидаз . Это обстоятельство исключает возможность применения сорбента, получаемого по известному способу, на ранних стадиях вьщеления фермента. Целью изобретения является получение биоспецифического сорбента для очистки аминопептидаз, обладающего высокой емкостью и устойчивостью к ферментам и микроорганизмам. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения биоспецифического сорбента для очистки аминопептидаз; который заключается в том, что в качестве нерастворимого носителя используют П-глицил-аминосилохрома. Исходный N-глицил-аминосилохром получают путем присоединения к аминосилохрому С-80 бензилоксикарбонилглицина с помощью известных методов образования амидной связи, в частности с помощью карбодиимидного метода, метода смешанных ангидридов, метода активированных эфиров и т.д. 4j . Непрореагировавшие аминогруппы силохрома блокируют путем ацетилирования. Затем отщепляют защитную бензилоксикарбонильную группу от остатков глицина. К N-глицил-аминосилохрому с помощью любого известного метода образования амидной связи в частнос.ти карбодиимидного, метода активированных эфиров или метода смешанных ангидридов присоединяют защищенный трипептид формулы NPS-Thr |ОВи)-PhePro-OH, синтезированный путем ацилирования известного пептидного ингибитора аминопептидаз - H-Thr( OBu )-Phe-Pro-OH б с о-нитрофенилсульфенилхлоридом. Непрореагировавшие аминогруппы N-глициламиносилохрома .блокируют обработкой нитромочевиной. Завершающей стадией синтеза биоспецифического сорбента является удаление о-нитрофенилсульфенильной защитной группы обработкой тиомочевиной. Синтез биоспецифического сорбента осуществляют согласно следующей схеме -NK-Gly-Z + Z-Gly-OH. l-NH-Gly-Z -ГГН-CO-CHjj NPS-Thr-{oBu)-Phe-Pro -NH-Gl:t--H -NH-Gly-H -NH-CO-СНэ9Bu HjNCONHNOj -NH-Gly-Pro-Phe-Thr -NH-Gly-HHCONHj

/I-NH-CO-CH-jOBu

1 NH-Gly-Pro-Phe-Thr-H j-NH-Gly- HCONHa

где Z

бензилоксикарбонил;

NPG о-нитрофенилсульфенил; OBu трет-бутил.

Предлагаемый сорбент содержит 92 мкмоль трипептида на 1 г сухого сорбента.

Пример 1. Получение H-Thr ( OBu )-P le-Pro-Gly-aминocилoхрома.

5-г аминосилохрома С-80 с содержанием аминогрупп 400 мкг-экв/г сухой смолы суспендируют в 20 мл диметилформамида (МДФА), через 5 мин ДМФА декантируют, к смоле прибавляю 0,84 мл триэтиламина в 25 мл ДМФЛ, выдерживают 5 мин и удаляют раствор триэтиламина декантацией. Смолу промывают 25 мл ДМФА, растворитель декантируют и повторяпот обработку 0,42 мл триэтиламина в 25 мл ДМФА в течение 5 мин. Раствор триэтиламина декантируют, промывают смолу ДМФА (3 раза по 20 мл) и прибавляют 1,254 г бензилоксикарбонилглицина;. в 20 мл ДМФА и через 5 мин прибавляют 1,236 г дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, повторно обрабатывают тем же количеством бензилоксикарбонилглицина и дициклогексилкарбодиимида и оставляют на ночь. Затем смолу отфильтровывают, промывают ДМФА (3x25 мл), зтанолом (3x25 мл-), хлористым метиленом и эфиром (по 3x20 мл).

Затем смолу снова суспендируют в 20 мл абсолютного ДМФА, обрабатывают 1,75 мл триэтиламина и через 3 мин вносят 1,17 мл уксусного ангидрида, после перемешивания в тече(Ние двух часов при комнатной температуре смолу промывают ДМФА (3x20 м этанолом (3x20 мл), хлористым метиленом (3x20 мл) и эфиром (3x20 мл). Затем смолу прогфлвают ледяной уксусной кислотой (3x20 мл) и обрабатывают 20 мл 40%-ного бромистого водорода в ледяной уксусной кислоте в течение 30 мин при комнатной тектертуре. Далее смолу промывают ледяной уксусной кислотой (3x20 мл, этанолом (3x20 мл хлористым метиленом (3x20 мл), хлороформдм (3x20 мл).

5 юбрабатывают 0,84 мл триэтиламина в 20 мл хлороформа в течение 5 мин, промывают 20 хлороформа и снова обрабатывают в течение 5 мин 0,42 мл триэтиламина в 20 г-ш хлороформа. Затем смолу промывают хлороформом (3x20 мл). ДГ4ФА (3x20 млЬ прибавляют 1,66 г NPS-Thr(OBu)-Phe-Pro-H в 20 мл ДМФА и через 5 мин 600 мг дициклогексилкарбодиимида, перемешивают 2 ч при комнатной температуре и оставляют на ночь. Смолу промывают ДМФА (6x10 мл) и этанолом (5x20 /Iл). Повторяют обработку смолы 0,328 г NPS-Thr(OBu )-Phe-Pro-OHи 0,206 г дициклогексилкарбодиимида в 20 мл ДМФА. Далее смолу, промытую хлороформом (3x10 мл), обрабатывсшзт 0,088 мл триэтиламина в 10 мл хлоро форма. Через 5 мин смолу промывают хлороформом (3x10 мл) и этанолом (3x10 г). Прибавляют 0,01785 г нитромочевины в 10 мл этанола и перемешивают 2 ч на водяной бане при . Промывают 10 мл этанола и повторяют обработку нитромочевиной.

Смолу проглывают абсолютным метанолом (3x10 мл) и смесью метанол-уксусная кислота 4:1, обрабатывают 0,910 г тиомочевины в 10 мл смеси метанолуксусная кислота 4:1 в течение 5 мин при комнат-ной температуре и переьдашивании. Смолу промывают метанолом (4x10 мл) и хлористым метиленом (3x10 мл). Содержание пептида составляет 92 мкмоль/г сухого сорбента.

В таблице приведены данные по очистке атлинопептидаз с помощью H-Thr ( )-Phe-Pro-Gly-aминocилoхрома. В экспериментах использован коммерческий препарат амилооризина П 10х, который был подвергнут предварительной очистке активированным углем и хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50, экстракт поверхностной культуры Trichoderma sp., который был осаждён сульфатом аммония и подвергнут гельфильтрации на Акрилексе Р-60, а также диализованная культуральная жидкость Вас. thurihgiensis. Количество нанесенного

5 и элюированного белка измерено в | NH-CO-CH|НВг/ЛсОН j NH-Gly-Z- l-NH-Gly-Z t NH-CO-CH«O u -NH-Gly-Pro-Rhe-Thr-NPS l-NH-Oly-H H2NCSNH2

условных оптических единицах, т.е. в единицах оптической плотности при 28.0 им. Активность ферментов измерена по СКОРО9ТИ гидролиза п-нитро/анилида L-лейцина 57 . Степень очистки ферментных препаратов характеризуется удельной активностью,т.е. количеством мкмолей расщепленного субстрата в.МИНУТУ на количество белка, выраженное в оптических единицах. Степень очистки определяется отношением удельной активности полученного препарата к удельной активности исходного раствора фермента. Таким образом, как видно из таблищл, полученный сорбент позволяет очищать с выходом 57-67% аминопептидазы микробиологического происхождения с увеличением активности в 9-20 раз в зависимости от чистоты исходного препарата. Сорбент обладает устойчивостью к микроорганизмам и ферментам и эффективен как при извлечении аминопептидаз из частично очищенных коммерческих препаратов , так и непосредственно из культуральной жидкости. Вследствие высокой избирательности сорбента значительный эффект достигается в одностадийном процессе очистки.

Сорбент может быть использован для работы многократно (не менее 35 раз) в течение года с растворами в широком диапазоне рН от 5,6 до

8,9, где аминопептидазы наиболее стабильны. Тогда как использование аналогичного аффинного сорбента, где матрицей служит сефароза 4В, для очистки аминопептидаз из препаратов

Trichoderma и ряда видов Aspergillus приводит, как правило, к полному гидролизу носителя за один - два цикла выделения фермента.

Кроме того, предлагаемый сорбент,

обладает более высокой по сравнению с известным сорбентом емкостью, за счет более высокого содержания пептидных лигандов на 1 г полимера.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФРИЕСКОГО СОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ АМЙНОПЕПТИДАЗ, включакяций модифт кацию нерастворимого носителя пептидным лигандом формулы H-Thr()-PhePro-OH, отличающийся тем, что, с целью увеличения емкости и повышения устойчивости сорбента к действию микроорганизмов и (ферментов, в качестве нерастворимого носителя используют N-глициламиносилЛхром. ko 4::а ОС 1

52,2 13,6 0,258 1,8 -9,2

1800 7,0 0,004 50,0 4,0 190 49,0 0,258 13,0 30,0

5,06 3,45 67,5 19

0,08 2,8 57,1 20,5

2,3 6,85 61,0 9