СПОСОБ ПРЕПАРАТИВНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Советский патент 1970 года по МПК G01N27/26 

Изобретение касается способа электрофореза (разделения веществ в электрическом поле).

Известен способ препаративного электрофореза, заключающийся в том, что препаративное выделение веществ из колонки, заполненной гелем, с электрическим полем, наложенным в осевом направлении, возможно элюированием через узкую проточную кювету, расположенную поперек колонки. При этом наблюдается малая разрешающая способность, т. е. разделение ограниченных количеств веществ (например, не более 100 мг белков). Кроме того, применяют пол тропицаемые мембраны для ограничения проточных кювет, на которых сорбируется часть разделяемых веществ.

По предлагаемому способу элюирование раздеьПяемых компонентов ведут не в поперечном, а в осевом направлении колонки. Подача буфера, введение электрода в проточную кювету и отвод образующихся газов осуществляют с помощью осевой трубки. Для обеспечения надежного обмыва электрода, находящегося в непосредственной близости or осевого выходного отверстия колонки предлагают -прерывистый режим электрофореза. При прерывистом режиме электрофореза питание электродов осуществляют лищь в начале образования капли. Осевое элюирование и отсутствие полупроницаемых мембран позволяет работать в более широких колонках с большими количествами вещества н лучщей разделяющей способностью.

Пример. Проводят разделение суммарных 5 белков фасоли сорта «Сакса, экстрагированных трис-глицнновым буфером с рН 8,3.

Диаметр опытной колонки на выходе 50 мл1 (приборы, выполненные по способу поперечной проточной кюветы, имеют колонки диаметром 0 не более 20 мм, в средней части колонки - 70 мм. Высота полиакриламидпого геля 8 см (7 см 7,5% гель-f 1 см 3,5% гель).

150-160 мг белка (рассчитан по азоту) наносят в смеси с линейным полимером акрила5 МИДа. Элюирование проводят трис-глициновым буфером, разбавленным вдвое, по сравнению с взятым для экстракции.

Около 30 час прибор рабогает в постоянном режиме электрофореза для разгонки белка, за0 тем еще свыше 150 час - в прерывистом режиме с элюированием. Скорость элюировапия 10-15 мл/час. Фракции собирают коллектором ХККВ-1 по 50 капель (около 4 мл). Количество белка в пробирках определяют в 1 мл 5 по Лоури.

Соотношение активного и пассивного режимов электрофореза задают 1 : 1 при времени образования капли около сек.

(анод в проточной кювете точечный - 0,3 см, катод кольцевой). Охлаждение колонки осуществляют водой со льдом. Прерывистый релсим поддерживают автоматически через систему: реле счета капель коллектора - реле времени - магнитный иускатель в цепи анода.

В результате разделения получают препаративно 23 компонента, которые идентифицируют кривой, построенной по интенсивности окраски белка по Лоури (с реактивом Фолнна). Кроме препаративного выделения, кривая позволила рассчитать фракционный состав исследуемой сложной смеси в процентах от нанесенного белка (по площади пиков).

На чертеже изображена полученная кривая элюирования суммарного белка семян фасоли сорта «Сакса.

Кривая на графике свидетельствует о хорощей разделяющей способности описанного способа.

С точки зрения особенностей фракционного состава фасоли отмечают, что белковый комплекс ее в основной массе представлен электрофоретически подвижными компонентами с относительно низкими молекулярными весами, так как подвижность белков в полиакриламидном геле зависит от величины молекул и связана с конкурентной гельфильтрацией.

Отмечено, что разделяющая способность препаративного электрофореза выше, чем непрепаративного микрометсда диск - электрофореза. По собственным данным {литературные данные отсутствуют) микрометодом выявлялось около 16 компонентов в исследуемой смеси, а препаративным - более 23.

Предмет изобретения

Способ препаративного электрофореза, основанный на разделении компонентов под действием электрического поля в колонке, заполнен.ной гелем, при элюировании разделенных компонентов буфером, отличаюш,ийся тем, что,

с целью повышения разделяющей способности, компоненты смеси элюируют из кюветы, находящейся под колонкой в осевом направлении при прерывистом режиме элекгрофореза.