СПОСОБ ЭЛЕКТРОФРАКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 1998 года по МПК B01D57/02 G01N27/28 

Изобретение относится к научным исследованиям в молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии, там, где требуется разделение, детектирование и очистка, таких биомолекул, как белки и нуклеиновые кислоты. Способ основан на электрофракционировании, то есть в принципе позволяет получать очищенным любой материал, который анализируется электрофорезом. Особенно же он дает большие возможности при очистке белков и ферментов, содержание которых в исходной белковой смеси очень низко, а обычные хроматографические процедуры дают очень слабый результат из-за сильного белкового комплексообразования. Это, в частности, относится к мембранным белкам. Здесь часто не обойтись без денатурирующего воздействия, которое происходит при электрофоретическом разделении по молекулярным массам в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Так как затем детектирование искомого фермента идет по его активности, то чрезвычайно важно получить на выходе максимально высокую концентрацию нужного фермента. В ином случае из-за сильной инактивации фермента его просто вообще не обнаружить. Данное изобретение позволяет не только не разбавлять искомый белок, но и получить его очищенным с концентрацией в несколько раз выше изначальной,
Известен способ по электрофракционированию биомолекул на основе их непрерывной элюции в проточную камеру, которая монтируется на выходе электрофоретической колонки (1). При этом способе колонка, представляющая из себя трубку с эаполимеризованным разделяющим полиакриламидным гелем, устанавливается вертикально в верхний и нижний резервуары для электрофоретического буфера, где монтируются электроды. Препарат наносится сверху на гель, подается напряжение, и идет разделение сверху вниз. Внизу на выходе трубки разделенные фракции попадают в специальную камеру, через которую прокачивается с постоянной скоростью элюирующий буфер, и попадают далее в УФ-детектор и коллектор фракций. Недостатком данного способа является прежде всего очень сильное разбавление разделяемых фракций на выходе элюирующим буфером. Если искомый белок является очень минорным в исходной смеси, его чрезвычайно трудно детектировать. Хотя последующий аналитический электрофорез разделенных фракций позволяет определить их молекулярную массу, но выяснить по ферментативной активности положение нужного белка практически невозможно из-за того, что разделение идет в денатурирующих условиях. Активность затем частично ренатурирует, но в условиях сильного разбавления ее обнаружить крайне сложно. Также, из-за сильного разбавления получается не очень высокое разрешение. В проспекте аппарата Model 491 Prep Cell дается величина в 2%, но по приведенному в том же проспекте разделению эта величина находится в пределах 10%. К тому же из-за очень узкого зазора между элюирующей камерой и электродным резервуаром сильно увеличивается время разделения. Кроме того, следует указать высокую себестоимость этого прибора, которая естественным образом связана со сложной системой элюирующей камеры.

Известен другой способ электрофракционирования, который также основан на непрерывной элюции разделенных фракций в поток буфера. Для его реализации вместо сложной элюирующей камеры изготавливается насадка, которая надевается на конец трубки (2). Электродный буфер нижнего резервуара через специальные отверстия прокачивается насосом мимо нижнего края разделяющего геля, подхватывает белки и подает их на УФ-детектор и коллектор фракций. Недостатком этого метода является опять же сильное разбавление образца на выходе и очень невысокое разрешение.

Наиболее близким по технической сущности к предложенному способу является способ, в котором очищенные белковые препараты получают дискретным сбором фракций на выходе разделяющего геля (3). Как и при первых двух способах проводится разделение белков в вертикальной трубке, только элюирующая камера на выходе отсутствует, а сбор фракций осуществляется прямо в нижний электродный резервуар. При этом фракционирование осуществляется путем периодической замены этого резервуара. Здесь недостатками опять же являются сильное разбавление и еще более слабое разрешение, к которым еще добавляются и проблемы с заменой нижнего резервуара.

Задачей изобретения является создание простого и дешевого способа, позволяющего электрофракционировать с высоким разрешением концентрированные отдельные белки с тем, чтобы иметь возможность затем детектировать непосредственно нужную ферментативную активность.

Согласно изобретению способ препаративного электрофракционирования схематично изображен на чертеже, показывающий схему электрофракционирования биомолекул. 1 - начальное положение; 2 - конечное положение; A - стеклянная трубка с разделяющим и концентрирующим гелем; B - электродные резервуары; C - уровень буфера в процессе электрофореза; D - уровень буфера при сборе фракций; E - секция сбора фракций; F - направление электрофоретической миграции молекул. Типы буферов и гелей используются в зависимости от исходного фракционируемого материала. Главное отличие от прототипа заключается в том, что отдельные фракции собираются не снизу, а сверку, что обеспечивается переворотом в процессе электоофореза трубки, в которой идет разделение. Это резко упрощает конструкцию, увеличивает разрешение и дает возможность собирать фракции в малом объеме. Для разделения используется стеклянная трубка (А) длиной в 90 мм с внутренним диаметром 13 мм и внешним 15 мм. Для того, чтобы сформировать полиакриламидный гель, нижний конец трубки закрывается парафильмом и заливается 150 мкл 50% глицерина. Затем на этот тяжелый раствор наслаивается более легкий раствор акриламида и бисакриламида, то есть полимеризовывается разделяющий гель высотой 75 мм и концентрирующий гель высотой 3 мм. После полимеризации парафильм снимается глицерин сливается и на его месте получается свободный объем в 200 мкл (Е). В данных экспериментах используется 10% разделяющий гель содержащий 0,375 М Трис, 0,1% додецилсульфат натрия, pH 8.8 и 5% концентрирующий гель, содержащий 0.125 М Трис, 0.1% додецилсульфат натрия, pH 6.8. Затем трубка фиксируется в аппарате с помощью резинового кольца и заливается стандартный электрофоретический буфер (50 мМ Трис, 150 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, pH 8,3) в оба резервуара (В). Емкость каждого из них 400 мл. Сверху наносится 500-1000 мкл образца, содержащего 500-1000 мкг белка и подается напряжение в 80 V. То есть идет обычное электро-форетическое разделение в трубке. В таком виде электрофорез проходит до тех пор, пока краситель бромфенол голубой (в данном случае он является маркером злектрофоретического фронта) не достигает конца разделяющего геля (Положение 1). Далее напряжение отключается, трубка переворачивается, полярность электродов меняется и буфер из верхнего резервуара меняется на стандартный электрофоретический буфер без додецилсульфата натрия, содержащий 0.2 M NaCl, 10% глицерин и 2 мМ 2-меркаптоэтанол, (буфер с высокой ионной силой). Подается напряжение в 100 V и продолжаются электрофорез. Теперь белковые зоны мигрируют не сверку вниз, а снизу вверх и собираются в вышеупомянутом объеме Е, где их подвижность замедляется из-за наличия 0,2 M NaCl. Для лучшего разделения белковых зон на гель дополнительно наслаивается 100 мкл плотного раствора 40%. глицерина, содержащего буфер с низкой ионной силой (10 мМ трис, 30 мМ глицин, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, pH 8.3, ). Образуется зона повышенного падения напряжения, где электрофоретическая подвижность разделяемых молекул резко увеличивается. Поэтому при выходе из геля они быстро проходят эту зону и тормозятся, упираясь в буфер с высокой ионной силой (Положение 2).

Фракционирование ведется следующим образом. Каждые 10 мин или чаще с помощью вытесняющего буфер устройства уровень буфера (D) в камере понижается, секция E отделяется от основного резервуара, и элюируемые белки, которые в ней собираются, отсасываются простой автоматической пипеткой в объеме 200 мкл. После этого уровень жидкости (C) опять поднимается; и буфер заполняет секцию E, в которую снова наслаиваются 100 мкл плотного раствора с низкой ионной силой. Электрическая цепь опять восстанавливается и электрофорез продолжается.

Экспериментальные исследования предложенного способа для получения в чистом виде ферментов протеин киназа и экзонуклеаза показали, что по сравнению со способом, взятым в качестве прототипа, предлагаемый способ обеспечивает с большим разрешением очистку отдельных белков из сложных белковых смесей. Более того, очищенные фракции получаются в концентрациях на порядок выше, чем в исходном образце, что позволило детектировать искомую ферментативную активность.

Список литературы:
1. Model 491 Prep Sell. Continious Elution Electrophresis. SDS-PAGE. Bio-Rad, проспект, (1992)
2. Electrofractionation: A Technique for Detecting and Recovering Biomolecules.

D.H.Shain, J.Yoo, R.G.Slaughter, S.E. Hayes, T.H.Ji, Analitical Biochem. , 200, 47-51, (1992)
Stopped Lower Buffer Flow Electrofractionation: Simple Electrofractionation for Complex Protein Mixture, J.Pyun, H.Choi, J.Park, Analitical Biochem., 223, 59-61, (1994)ь

Назначение: изобретение предназначено для использования в молекулярно-биологических исследованиях и в биотехнологии, где требуется получение чистых препаратов белков и нуклеиновых кислот. Сущность изобретения: способ электрофракционирования осуществляют путем разделения объектов в геле, заполимеризованном в трубке, помещенной вертикально между верхним и нижним электронными резервуарами, и последующего сбора отдельных фракций на выходе из геля. Направление движения фракций в процессе электрофореза меняют посредством переворота трубки; отдельные фракции собираются в максимально высокой концентрации в верхней части трубки, причем для лучшего их разделения на выходе из геля формируют зону повышенного или пониженного напряжения посредством изменения буфера. 1 ил.

Способ электрофракционирования белков и нуклеиновых кислот, включающий их разделение в геле, заполимеризованном в трубке, расположенной вертикально между верхним и нижним электродными резервуарами, и сбор фракций на выходе из геля, отличающийся тем, что в геле со стороны, противоположной месту ввода пробы, формируют участок сменного буфера, в процессе электрофореза трубку переворачивают с изменением полярности электродных резервуаров, а на выходе из геля формируют зону повышенного или пониженного напряжения посредством изменения буфера.