СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЛИПАЗЫ Советский патент 1970 года по МПК C12N9/20 

Изобретение отиосится к фермеитной промышленности и представляет собой способ выделения ферментных препаратов, например липазы, из сырья животного происхождения. Препарат может быть использован как реактив для исследовательских работ.

Уже известен способ получения иреиарата липазы из сухой, обезжиренной и измельченной поджелудочной железы свиней.

Липазу получают экстрагированием измельченной обезжирениой и высушенной ацетоном железы с последуюи им удалением балластных белков и осаждение.м липазы путем многократного высаливания сульфатом аммония и дальнейшей сушкой липазы.

Большие объемы реакционных смесей, иолучаюшихся в результате применения насыщениого раствора сульфата аммония в качестве осаждаюшего реагента, а также наличие большого количества слизистых и балластных веществ затрудняет фильтрацию раствора. Это значительно усложняет процесс производства липазы и увеличивает его трудоемкость.

Для повышения выхода ферментного препарата предлагается на первой ступени высаливания резко изменять рН среды вначале от 6,0 до 9,0 и виовь от 9,0 до 6,0. Осаждаюшнй реагент - сульфат аммония исиользуют в кристаллическом виде. Очистку лииазы осуществляют диализом против 0,02 н. ацетатного буфера при рН, равном 5,0.

Предлагаемый способ осуществляют по следующей технологии.

Сухую измельченную и обезжиренную поджелудочную железу свиней экстрагируют водой в соотношении 1 : 10, затем при перемешивании отделяют жмых. После этого высаливают балластные белки и осаждают липазу

иутел многократного высаливания с}льфатом аммония.

При иервой ступени высаливание балластиых белков из экстракта кристаллическим сульфатом аммония осуществляют до степени

иасыщения 0,2, при этом резко изменяют рП среды от 6,0 до 9,0 п от 9,0 до 6,0.

После фильтрацти липазу высаливают из фильтрата кристаллическим сульфатом аммония до степени насыщения 0,5, затем опять

фильтруют и растворяют осадок лииазы в воде в соотношении 1 : 4 к весу осадка.

Высаливание балластных белков кристаллическим сульфатом аммония до степени насыщения 0,2 осуществляют на следующей ступени и фильтруют.

Затем лппазу высаливают из фильтрата кристаллическим сульфатом аммония до степени насыщения 0,45, фильтруют и растворяют осадок лииазы в воде в объеме 1 ; 4 с

& соотношении 1 : 0,4 соответственно к весу осадка.

После этого липазу осаждают ацетоном при - 12°С до концентрации 46%, отстаивают при темиературе -12°С, фильтруют и растворяют осадок лнпазы в воде в соотношении 1 : 10 к весу осадка ирн рН 7,6.

Затем осуществляют диализ раствора линазы против 0,02 н. ацетатного буфера при рН 5,0 в теченне 48 час н лиофильную сушку лниазы.

Пример. 50 е сухой, измельченной н обезжиренной поджелудочной железы свиней экстрагируют в 500 мл воды в течение 2 час при неремешиваннн и отделяют . Затем измеряют объем нолученного экстракта и высаливают балластные белкн до стеиени насыщения 0,2 кристаллическим сульфатом аммония. Для .коагуляции балластных белков производят быструю смену рН раствора, увеличивая его от 6,0 до 9,0 добавлением аммиака и затем резко снижая от 9,0 до 6,0 нодкнсленнем 50%-ным раствором серной кислоты. Балластные белкн отделяют фильтрацией. Из фильтрата липазу осаждают кристаллическим сульфатом аммония до стененн насыщения 0,5 и отделяют фильтрацией под вакуумом. Полученный осадок лнназы растворяют в 4 об. воды с последующим высаливанием балластных белков кристаллическим сульфатом аммония до 0,2 насыщения. Балластные вещества удаляют фильтрацней. Из полученного фильтрата вновь осаждают липазу кристаллическим сульфатом аммония до 0,45 насыщения и отфильтровывают под вакуумом. Осадок линазы растворяют в 4 об. воды с добавлением 0,4 об. ( к весу осадка)

1 М раствора сульфата аммония. Осаждение лнназы нз раствора производят ацетоном при температуре -12°С и 46%-ном насыщении. После 30-мииутного перемешивания нри той же температуре осадок липазы отфильтровывают н растворяют в 10 об. воды, подщелоченной раствором аммиака до рН 7,6. Раствор деализуют против 0,02 и. ацетатиого буфера ири рН 5,0 в течение двух суток и лиофильно высушивают.

Выход лнофнльно высушенного препарата лнпазы 0,15 г.

Активность ирепарата 55000, 83000 (по трибутнрнну).

Предмет изобретения

1. Способ выделения фермеитного иренарата липазы из животиого сырья, например

поджелудочной железы свиньи, путем экстрагирования измельченной обезжиреиной и высушенной ацетоном железы с иоследующнм удалением балластных белков и осаждением лнназы путем многократного высаливания

сульфатом аммония, и дальнейшей очисткой линазы, отличающийся тем, что, с целью новыщення выхода ферментного ирепарата, на первой ступени высаливания резко изменяют рН среды вначале от 6,0 до 9,0 и вновь от

9,0 до 6,0.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что сульфат аммония используется в кристаллическом виде.

3.Способ по н. 1, отличающийся тем, что очистку липазы осуществляют диализом против 0,02 н ацетатного буфера нри рН, равном 5,0.