СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, СОДЕРЖАЩИХСЯ В ДРОЖЖЕВБ1Х КЛЕТКАХ Советский патент 1970 года по МПК A23J1/18 

11

Известен способ получения биологически активных веществ (наиример, ферментов, витаминов), .содер каш,ихся в дрожжевых клетках. Согласно этому способу клетки дрожжей разрушают этилацетатом, полученную суспензию разделяют одним из известных способов, например фИльтращией, получая при этом жидкую и твердую фазу. Из твердой фазы высаливают растворимые вещества раствором сульфата аммония. Жидкую фазу разделяют фильтрацией на фильтрат и белковый осадок.

Предлагаемый способ обеспечивает получение более щирокого комплекса содержащихся в дрожжах биологически активных веществ, например ферментных препаратов - дитохрома С, рибонуклеазы, рибонуклеиновой кислоты, эргостерина - источника витамина D. С этой целью цитохром С выделяют из фильтрата путем пропуска последнего через ионообменные колонки с последующим элюироваиием уловлеиного на них цитохрома. С. Рибонуклеазу выделяют из раствора, прошедщего через колонки, осаждением риванолом с последующим иолучением ее из осадка в кристаллическом виде.

Рибонуклеиновую кислоту получают путем обработки белко-вого осадка щелочью, а эргостерин - путем воздействия на белковый осаП.ОК спиртом.

Высаливание растворимых веществ из осадка следует вести 50%-ным раствором сульфата аммония при температуре 10-15°С.

Пример. К 10 г прессованных дрожжей вида Sacharomyces cerevisie добавляют 3,225 yi этилацетата и оставляют на. час при 10-15°С. ЗателМ полученную суспензию фильтруют. Осадок суспендируют в растворе сульфата аммония (3,225 кг сульфата аммония растворенного в 15 . воды, 50% от степени насыщения). Экстракцию раствором сульфата аммония проводят в течение 48 час при перемещивании и температуре .

Белковый осадок отделяют, а фильтрат диализуют в течение 36 час.

Для получения цитохрома С фильтрат пропускают через колонку с ионообменной смолой при рН 7,0. При этом цитохром С выделяется на смоле, а рибонуклеаза в растворе

проходит через колонку. Колонку промывают 3 л 0,05 М раствора сульфата аммония, после чего элюируют раствор цитохрома 1,5 л 0,2 М раствора сульфата аммония. Полученный раствор цитохрома С диализуют в течение 18 час, фильтруют, затем пропускают через колонку с ионообменной смолой при рП 7,0. Колонку промывают 500 мл 0,25-0,3 М аммонийно-ацетатного буфера, после этого элюпруют 0,5 М раствором аммиака (600- Полученный раствор диализуют в течение 18 час и пропускают через колонку с ионообменной смолой (КБ-1, КБ-2, КБ-4, СГ-1) при рН 9,6 для концентрирования. Элюацию проводят 0,5 М водным раствором аммиака (100-150 мл). Концентрирова«ный раствор цнтоХрома С подвергают лиофильной сушке. Для получения рибонуютеазы ,к раствору, прошедшему через первую колонку, объем которого составляет 15 л, доливают при перемешивании 5,6 л 1%-ного водного раствора риванола и оставляют при температуре :не выше 10°С на 2 час. Образу1ош,ий-ся комплекс рибонуклеаза - риванол выпадает в осадок, который отфильтровывают. Осадок (13 г) растворяют в 5 л 1 М pacTBOipa ацетата натрия, прибавляют 2 объема ацетона и держат на холоде в течение 24 час. Выпавшие кристаллы рибонуклеазы отфильтровывают (13 г). Осадок растворяют в 100 мл воды, раствор охлаждают и доливают IK нему .при перемешивании двойной объем ацетона. Оставляют на 12 час при охлаждении, после чего фильтруют. Переосаждение повторяют еш,е раз. В результате получают 7 г кристаллической рибонужлеазы. Для получения рибонуклеиновой кислоты белковый осадок, полученный после экстракции цитохрома С « рибонуклеазы сульфатом аммония, промывают 5 л воды на фильтре, затем суспендируют в 7 л 2 н. раствора едкого натра. Экстракцию рибонуклеиновой кислоты щелочью ведут при перемешивании в течение I час. Затем приливают 1100 мл ледяной уксусной кислоты, доводя рП смеси до 6,0, -и фильтруют. К полученному фильтрату приливают двойной объем сширта в количестве 4,5 л. Спустя 4 час осадок рибонуклеиновой кислоты отфильтровывают и получают 180 г ее. Затем рибонуклеиновую кислоту растворяют в 1600 мл |Воды, осаждают одинарным объемом сиирта и фильтруют. Для получения эргостерина фильтрат, полученный после удаления рибонуклеиновой кислоты, обрабатывают спиртом. Выход цитохрома С 200 мг, рибонуклеазы 7 г, рибонуклеиновой кислоты 70-80 г, эргостерина 16 г. Предмет изобретения 1. Способ получения биологически активных веществ, содержащихся в дрожжевых клетках, путем разрущения их этилацетатом, отделения твердой фазы от жидкой одним из извествых способов, высаливания растворимых веществ из твердой фазы раствором сульфата аммония, разделения жидкой фазы путем фильтрации на белковый, осадок и фильтрат, отличающийся тем, что, с целью получения более широкого комплекса содержащихся в дрожжевых клетках биологически активных веществ, например ферментных препаратов - цитохрома С, рибонуклеазы, рибонуклеиновой кислоты, эргостерина - источника витамина D, цитохром С выделяют из фильтрата при (ПОМОЩИ ионообменных смол, например КБ-1, КБ-2, КБ-4, СГ-1, рибонуклеазу получают из раствора, освобожденного от цитохрома С, осаждением риванолом с последующим получением ее в кристаллическом виде из осадка одним из известных способов, а рибонуклеиновую кислоту и эргостерин получают путем последовательной обработки белкового осадка щелочью и спиртом. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что высаливание растворимых веществ из осадка ведут раствором сульфата аммония при температуре 10-15°С.