Способ получения ферментного препарата из поджелудочной железы убойных животных Советский патент 1984 года по МПК A61K38/46 C12N9/64 C12N9/66 

О

сь Nl Изобретение относится к способам получения полиферментных препаратов лечебного действия и может быть использовано на пред приятиях мясной промышленности. Известен способ получения ферментного препарата коллагеназиого действия из поджелудочной железы убойных животных, включающий экстракцию измельченного сырья аце татным буфером рН 4,6-4,7, отделение экстракта от жмыха и выделение целевого про дукта экстракцией жмыха 0,75 М раствором NaCI, фракционированным осаждением белков сульфатом аммония (обычно при степени насьпцения 0,25-0,35 и 0,45-0,6) с по-: следующим отделением осадка фермента и диализом 1. При изготовлении препарата коллагеназного действия после экстракции ацетатным буфером экстракт, содержащий фермент эпастазно го действия, сифонируют, что {фиводат к по терям ценного вещества. Целью изо ретения является безотходное и пользование сырья и дополнительное извлечение из него фермента эластазного действия. Указанная цель достигается тем, что соглас но способу получения ферментного препарата из поджелудочной железы убойных животных предусматривающему экстракцию измельченного сырья ацетатным буфером рН 4,6-4,7, разделение экстракта и жмыха и выделение фермента коллагеназного действия экстракцией 0,75 М раствором NaCI, фракцио1шрованным осаждением белков сульфатом аммония, отделение осадка фермента и диализом, в отделенном от жмыха экстракте осаждают балластные белки сульфатом аммония при степени насыщения 0,16-0,17, осадок отбрасывают, а из фильтрата сульфатом аммония при степени насыщения 0,45-0,46 осаждают фермент эластазного действия, после чего ментный осадок растворяют в карбонатном буфере при рН 9,1-9,2 и подвергают диализу с последующим обьедииением диализатов и фильтрацией. Способ позволяет комплексно использовать животное сырье, утшшзировать отходы и получить полнферментяый препарат. Пример 1. 1кг обезвоженной и измельченной поджелудочной железы свиней экстрагируют ,6 обьемами 0,1 М ацетатиого буфера рН 4,6. Экстракция длится 8 ч. Первые. 2 ч экстрагирование 1ФОИЗВОДИТСЯ при непрерывном перемешивании, последующие 6 ч перемешивают каждый час по 10 мин. Экстракт отстаивается 2Q ч при температуре не вцше 5°С. Отстоявшуюся жидкость сифонируют, а жмых подвергают вторичному экстрагированию. Балластные белки высаливают из экстракта добавлением небольшими порциями, при перемешивании, кристаллического сульфата аммоюш до степени насыщения 0,16-0,17. Осадок отделяют фильтрацией на нутч-фильтре или специальном фильтрующем устройстве при температуре не выше . Из фильтрата медленно высаливают фермент добавлением кристаллического сульфата аммония до степени насыщения 0,45- 0,46, с поверхности снимают пену и оставляют при температуре не выше 5° С. Осадок выдеряшвают 16 ч при температуре ие выше 5°е. Затем надосадочную жидкость сиф жируют, а осадок отделяют фильтрацией на 1 пгч-фильтре. Осадок растворяют в 3-х обьемах 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,1 и разливают в целлофановые мешки по 100-150 мл. Диализ проводят 48 ч при температуре не выше 5С против дистиллированной воды. Жмых суспензируют в 0,75 М растворе хлористого натрия (7,5 о&ьемов к массе исходного сырья) и экстрагируют 3,5 ч при непрерывном перемешивании к температуре ие выше 5 С. После 3 часового отстаивания экстракт отделяют сифонироваиием, фильтрацией ка нутч-фильтре или прессованием иа гидравлическом прессе. Балластные белки из экстракта высаливают добавлением небольшими портшями, при перемеагаваиии кристаллического сульфата аммоийя: до степени насьпцения 0,26-0,27. Осадок отделяют фильтрацией на нутч-фильтре или на специальном фильтрующем устройстве при температуре ие выше 5° С. Из фильтрата высаливают фермент добавлением небольошми порциями при перемешивании кристаллического сульфата аммоийя до степе ш насьпцения 0,6-0,7 при температ) не выше 5 Осадок выдерживают 16ч при температуре ие выше 5° С, Затем надосадочную жидкость сифоиируют, а осадок отделяют на нутч-фильтре.Осадок растворяют в 3-х обьемах дистиллированной воды и разливают в целлофановые мешки по 100-150 мл. Диализ проводят 48 ч при температуре не выше 5 С против дистиллированной воды со сменой вода: каждые-6 ч. t и II осадки и диаллизаты обьединлют и фильтруют на нутч-фильтре. Осадок растворяют в 2-х обьемах 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,1. Раствор фильтруют на нутч-фильтре через кизельгур. Раствор стерилизуют и разливают во флаконы. Выход лиофилизированного препарата 8-10 г. Пример 2. Первая экстракция высушенной и измельченной железы проводится, как и в первом примере, но при 1 4,65 . Перемешивание каждый час осуществляется в течение 12 мин. Далее все проводатся как и в первом п{жмере, но после высаливания фермента пря первой кстрак они осадок вьздерживается 17 ч при температуре не выше 5°С. После сифонировашш надосадочнрй жидкости и отдельния осадка на нутч-фильтре осадок растворяют в 3-х объемах 0,1 М карбонатного буфера при рН 9,15. , И экстракция жкшха ос}1аествляется как в примере 1, но экстракт отстаивается 3,5 ч Отделение балластных белков и осаждение фермента после II экстракции провощггся как в примере 1, но осадок фермента выдерживается в течение i ч при температуре не вы1ие 5°С. Далее все операхщи проводят как в примере 1, но после объединения I и М осадке и диализатов получившийся х садрк растворяют в 2-х объемах 0,1 М карбонатного буфера при рН 9,15. Пример 3. Первая экстраюшя высу шейной и измелъченной железы проводится как и в первом примере, но при рН 4,7. Шремешивание каждъш час осуществляется в течеш{е 15 мин. Далее все операции проводят как в примере 1, но после высаливания фермента при первой экстракции осадок вьщерживается 18 ч при температуре не выше .После (жфонярования надосадо шой жидкости .и отделения осадка на иутч-фильтре, осадок растворяют в 3-х объемах 0,1 М карбонатно го фера ярм рИ 9,2. II экстракция жмыха осуществляется как в примере 1, но экстракт отстаивается 4 ч. Отделение балластнъ1х белков и осаждение фермента после II экстракции проводится как в примере 1, но осадок фермента въщерживается в течение 18 ч п{я{ температурене вьппе 5° С. Далее операции проводят как в примере 1, но после объединения I и II осадков и диализатов получившийся осадок раство ряют в 2-х объемах 0,1 М карбонатного буфера при рН 9,2. Изобретение позволяет получитъ полиферментнъш препарат для применения в хирургической практике.. По сравнению с известным способом предлагаемъш обладает более широким спектром ферментного действия, имея не только активность коллагеназного действия, но и эластазного действия. Сопоставительный анализ показателей пред-латаемого способа и прототипа приведен в таблице.

СПОСОБ ПОЛУЧШгИЯ ФНРМЕИГ-НОГО IffEIIAPATA ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕШ ЖШОТКЫХ, предусматргаающий экеграквзао «зметлетюго сырья ацетапшм буфером jtff 4,6-4,7, разделение экстракта и жмыха и вьзделение из последнего фермента коллагенаэного действия экстракцией 0,75 М раствором NaCI, фракционированным осаждением белков сульфатом аммония, отделением осадка фермента и диализом, отличающийся тем, что, с целью безотходного использования сырья и дополнительного извлечения из него фермента эластазного действия, в отделенном от жмыха экстракте осаждают баплжяные белки сульфатом аммония при стеHeiffl насыщеюм 0,16-0,17, осадок отбрасывают, а из фильтрата сульфатом аммония при степею насыщения 0,45-0,46 осаждают фермент зластазиого действия, после чего ферментный осадок растворяют в карбонатном буфере ври рЯ 9,1-9,2 н подвергают диализу с последующим объединением диализатов н фильтрацией.