СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С Советский патент 1994 года по МПК A61K35/34 G01N33/48 C12Q1/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения лекарственных препаратов из сердца.

Цель изобретения - упрощение способа и повышение выхода целевого продукта за счет использования определенного режима экстракции, проведения замораживания и оттаивания раствора перед диализом, при этом в качестве сырья используют сердца ластоногих.

П р и м е р 1. Берут 50 кг замороженных сердец морского котика, размораживают, промывают водой от сгустков крови, очищают от жира и связок, измельчают на волчке с диаметром решетки 2 мм, получают 26,5 кг фарша.

К 26,5 кг фарша добавляют 2,5% -ный раствор трихлоруксусной кислоты до pH 3,8 и 2 ч экстрагируют при комнатной температуре и периодическом перемешивании. Экстракт отделяют на нутч-фильтре. Объем экстракта 30 л.

В экстракт добавляют 10% -ный NaOH до pH 7,0 и осаждают балластные белки сульфатом аммония в количестве 500 г/л кристаллического сульфата аммония на 30 л экстракта, перемешивают. Отстаивают 20 мин и фильтруют через бумажные фильтры. Получают 33 л фильтрата.

К прозрачному фильтрату добавляют 1,65 кг кристаллического сульфата аммония (в количестве 50 г/л). Отстаивают 20 мин, фильтруют через бумажные фильтры. Объем фильтрата 34 л.

К прозрачному фильтрату добавляют при перемешивании 20% -ный раствор трихлоруксусной кислоты из расчета 25 мл на 1 л раствора. Через 15-20 мин сформировавшийся осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Осадок цитрохрома С обрабатывают насыщенным раствором сульфата аммония, 500 мл на 1 кг исходного сырья центрифугируют в течение 1 ч, отделяют осадок. Собранный осадок растворяют в 200 мл дистиллированной воды и замораживают при -15^оС, размораживают и отфильтровывают.

Крепкий раствор цитохрома С объемом 200 мл разливают в двойные целлофановые мешочки и ставят на диализ против физиологического раствора на сутки. Полученный раствор нагревают в течение 1-2 мин при 85^оС фильтруют, фильтрат разводят физиологическим раствором до концентрации цитохрома 2,5 мг/мл, стерильно фильтруют, разливают во флаконы по 10 мг препарата и лиофилизируют.

Выход цитохрома С от исходного сырья 6,620 г.

П р и м е р 2. Берут 10 кг замороженных сердец нерпы, размораживают, промывают водой, удаляют жир и связки. Измельчают на волчке. Получают 5 кг фарша. К нему добавляют 2,5% -ный раствор трихлоруксусной кислоты до установления pH 3,8 2 ч экстрагируют, периодически перемешивая. Экстракт отделяют фильтрованием, добавляют в него 10% -ный NaOH до pH 6,0 и осаждают балластные белки 3 кг кристаллического сульфата аммония, перемешивают. Дают отстояться 20 мин и фильтруют через бумажные фильтры.

Получают 6,6 л фильтрата, к нему добавляют 0,3 кг кристаллического сульфата аммония, перемешивают. После отстаивания фильтруют. К 6,8 л полученного фильтрата при перемешивании добавляют 20% -ный раствор трихлоруксусной кислоты, через 20 мин осадок отделяют центрифугированием. Осадок обрабатывают насыщенным раствором сульфата аммония (500 мл на 1 кг исходного сырья), центрифугируют.

Собранный осадок цитохрома С растворяют в 40 мл дистиллированной воды и замораживают при -12^оС, размораживают и отфильтровывают. Крепкий раствор (40 мл) помещают в целлофановый мешочек и ставят на диализ против физиологического раствора на сутки.

Полученный раствор нагревают в течение 2-3 мин при 85^оС, фильтруют, фильтрат разводят физиологическим раствором до концентрации цитохрома 2,5 г/л, стерильно фильтруют, разливают во флаконы по 10 мг препарата и лиофилизируют.

Выход цитохрома С от исходного сырья 1,400 г.

П р и м е р 3. Берут 10 кг замороженных сердец морского котика, размораживают, промывают водой, удаляют жир и связки, измельчают на волчке. Получают 5 кг фарша, к нему добавляют 2,5% -ный раствор трихлоруксусной кислоты до pH 4,1, 2 ч экстрагируют, периодически перемешивая. Экстракт отделяют фильтрацией, добавляют к нему 10% -ный раствор NaOH до pH 7,0 и осаждают балластные белки 3 кг кристаллического сульфата аммония при перемешивании. Дают отстояться в течение 20 мин и фильтруют через бумажные фильтры. Получают 6,5 л фильтрата, к которому добавляют 0,325 кг кристаллического сульфата аммония при перемешивании. После отстаивания фильтруют.

К прозрачному фильтрату (6,7 л) при перемешивании добавляют 20% -ный раствор трихлоруксусной кислоты из расчета 25 мл/л. Через 20 мин осадок цитохрома С отделяют центрифугированием. Осадок обрабатывают насыщенным раствором сульфата аммония в количестве 500 мл на 1 кг исходного сырья и центрифугируют.

Полученный осадок цитохрома С растворяют в 40 мл дистиллированной воды и замораживают при -12^оС. Размораживают и отфильтровывают. Крепкий раствор цитохрома С (40 мд) помещают в целлофановый мешочек и ставят на диализ против физиологического раствора на сутки.

После диализа раствор цитохрома С прогревают в течение 2-3 мин при 85^оС, охлаждают и фильтруют. Фильтрат разводят физиологическим раствором до концентрации 2,5 г/л, стерильно фильтруют, разливают во флаконы по 10 мг препарата и лиофилизируют.

Выход цитохрома С от исходного сырья 1,38 г.

П р и м е р 4. Берут 20 кг замороженных сердец тюленей, размораживают и подготавливают сырье, измельчают его на волчке, получают 10 кг фарша. Добавляют 2,5% -ный раствор трихлоруксусной кислоты до pH 4,0, величину которого замеряют на потенциометре ЛПУ-01 с допустимой погрешностью 0,05. Экстракцию проводят 2 ч, периодически перемешивая. Экстракт отделяют фильтрованием, добавляют в него 10% -ный NaOH до pH 7,0 и осаждают балластные белки сульфатом аммония (500 г/л), отстаивают и отфильтровывают. К прозрачному фильтрату добавляют сульфат аммония (50 г/л) и фильтруют. К 13,5 л полученного фильтрата добавляют 20% -ный раствор трихлоруксусной кислоты (25 мл/л), через 20 мин осадок цитохрома С отделяют центрифугированием и обрабатывают его насыщенным раствором сульфата аммония.

Собранный осадок растворяют в 100 мл дистиллированной воды и замораживают при -10^оС, размораживают и отфильтровывают. Крепкий раствор цитохрома С разливают по 50 мл в двойные целлофановые мешочки и ставят на диализ против физиологического раствора на сутки.

Полученный обессоленный раствор цитохрома С нагревают в течение 2-3 мин при 85^оС, охлаждают и фильтруют. Фильтрат разводят физиологическим раствором до концентрации цитохрома С 2,7 мг/мл, стерильно фильтруют и разливают во флаконы по 10 мл препарата.

Выход цитохрома С от исходного сырья составляет 2,8 г.

Зависимость выхода цитохрома С из 1 кг исходного сырья (сердце морского котика) от pH в экстракте показана в табл. 1.

Сравнительные данные по выходе цитохрома С из 1 кг сердец морского котика в предложенном способе и способе-прототипе представлены в табл. 2 (56) Авторское свидетельство СССР N 551546, кл. A 61 K 35/34, 1972.

Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - упрощение способа и повышение выхода целевого продукта. Берут 10 кг замороженных сердец нерпы, размораживают, промывают водой, удаляют жир и связки. Измельчают на волчке. К полученному фаршу добавляют раствор трихлоруксусной кислоты до рН 3,8 - 4,1. Затем в течение 2 ч экстрагируют. Экстракт отделяют фильтрованием, добавляют NaOH до рН 6,0 и осаждают белки кристаллическим сульфатом аммония. После фильтрации к полученному фильтрату добавляют кристаллический сульфат аммония. После отстаивания раствор фильтруют. К фильтрату добавляют 20% -ный раствор трихлоруксусной кислоты. Осадок отделяют центрифугированием. Осадок обрабатывают раствором сульфата аммония и центрифугируют. Осадок цитохрома "С" растворяют в дистиллированной воде и замораживают при температуре (-10)-(-15)С, затем размораживают и фильтруют. Крепкий раствор ставят на диализ. Полученный раствор нагревают и фильтруют. Фильтрат разводят физиологическим раствором, стерильно фильтруют, разливают во флаконы и лиофилизуют. 2 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С, включающий промывание сердечной мышцы животных водой, измельчение ткани, экстракцию органической кислотой, обработку экстракта сульфатом аммония, осаждение цитохрома С органической кислотой, центрифугирование, обработку полученного осадка сульфатом аммония, диализ раствора, удаление пирогенных белков нагреванием и осаждением с последующими стерильной фильтрацией и лиофилизацией супернатанта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода целевого продукта, в качестве сырья берут сердце ластоногих, экстракцию проводят при рН 3,8 - 4,1, а перед диализом раствор замораживают при температуре (-10) -- (-15)^oС, затем размораживают и фильтруют.