ПАТЕНТНО-ТЕХН^^НЕСКАЯБИБЛИОТЕКА Советский патент 1970 года по МПК A23K1/175 

изобретение относится к способам нолучения химических соединений, в особенности к способам получения соединений с использованием бактериальных культур.

Известен способ получения изорениератена и его 3-окси- и 3,3-диоксипроизводных с помощью химического синтеза. Однако известный способ довольно сложен и, следовательно, требует больших затрат.

С целью упрощения технологического нроцесса предлагается получать изорениератен и его 3-окси- и 3,3-диоксиироизводные биологическим путем с использованием культуры гриба Streptomyces mediolani (штамм 2215/74F.i. из Коллекции штаммов Фермиталия). Штамм также депонирован в Институте фитопатологии при Миланском университете иод № LP.V. 1952 н в Международном микологическом институте под № I.M.I. 134886.

Пиже дано описание морфологических и культурных признаков этого гриба. А. Вид под микроскопом

На простой культуральной среде вегетативный мицелий в виде более или менее тонких гифов толщиной 0,4-0,9 мкм с многочисленными длинными разветвлениями, которые образуют более крупные гифы толщиной 1 - 1,3 мкм, длинные и переплетенные. Из этих гифов моноподиально ответвляются гифы, образующие споры или сиорофоры, которые сильно или слегка вьются, длинные, образованные малыми цепочками спор, которые вначале связаны, затем свободны. Споры гладкие, чаще кубической формы, иногда также цилиндрической и округлой формы. Под микроскопом они выглядят в виде характерных кубиков размером (0,9-1,1) X (0,9-1,1) мкм.

Б. Микроскопический вид

В табл. 1 ириведены культуральиые свойства на средах, в которых S. mediolani выращивался при 28° С, причем наблюдения были проведены на 3-й, 8-й, 15-й и 20-й дни после инокуляции.

Гриб проявляет быстрый обильный рост с образованием компактного твердого вегетативного М1щелия в виде ровной патины, окрашенной в цвета от яично-желтого до оранл ево-желтого. Воздушный мицелий, также обильный па всей культуральной среде, довольно схож по виду с хлопком, окрашен в цвета от ваиильно-желтого до гвозд.ично-желтого. Значительных различий между грибами, выросшими на синтетической и органической средах, не обнаруживается.

В. Био.химические свойства

Рост

Среда

Обильный, в виде ровной натины

Умеренный, в виде ровной патнны

Обильный, в виде

й ровной натины

Обильный, в виде слегка складчатой натины

Обильный, в виде складчатой патины

Обильный, в внде

и ровной патины

Обильный, в виде ровной патины

Обильный, в виде ровной натины

Обнльный, в виде ровной патины

Обильный, в виде ровной патины

Обильный, в виде ровной патины

Обильный, в виде ровной натины Примечание. Растворимый нигмент отсутствует при

Таблица 1

Возушный мицелий

Вегетативный мицелий

Яично-желтый или абрикосово-желтый с обеих сторон

От лимонио-желтого до абрикосово-желтого цвета с обеих сторон

Лимонно-желтого цвета с обеих сторон

Абрикосово-желтого цвета с обеих сторон

Апельсиново-желтого цвета с обеих сторон

Лнельсииово-желтого цвета с обеих сторон

Анельсиново-желтый с обеих сторон

Светлый оранжево-желтый с обеих сторон

Оранжево-желтого цвета с обенх сторон

Глубокого оранжево-желтого цвета с обеих сторон

Оранжево-желтый с обеих сторон

Светлый оранжево-желтый с обеих сторон выращивании на всех средах.

ДНЯ положительная. Крахмал гйдролизует. Молоко не коагулирует, но пептоиизирует. Меланин не образует. Тирозин разлагает. Образует нерастворимые пигменты.

Используют следующие источники углерода: глюкозу, /-арабинозу, сахарозу, d-ксилозу, dманпитол, d-фруктозу, мальтозу, рамнозу и глицерин; мезоинозитол и раффинозу не используют.

Гриб не растет при 50° С и не образует склероций. Погруженная в воду и взбитая культура образует -изорениератен, 3-оксиизореииератен и 3,3-диоксиизорер1иератен.

Г. Идентификация гриба

Свойства, проявляемые грибом и описанные выше, позволяют отнести его к роду Streptomyces Waksman et Hehrici (Bergeys Mannuel of Determinative Bacteriology, 1957, стр. 774- 775). По Fridman et al. он принадлежит к Rectus Flexibilis группа «желтых (Appl. microbioL, 6, 1958, стр. 52).

вестных подвидов, предложенных Waksman, Baldacci et al.. Cause et al., Flagi et al., Ettingener et al.

Сравнение свойств рассматриваемого гриба и известных показало, что «и один из последних не имеет всех тех свойств, которыми обладает рассматриваемый микроорганизм.

Отсюда следует, что рассматриваемый микроорганизм не может быть идентифицирован с каким-либо видом, описанным в литературе, и поэтому его следует рассматривать как новый вид. Ему было дано название S. mediolani.

Он может быть размножен путем инокуляций на твердой среде или путем лиофилизации суспензии спор в молоке.

Согласно изобретению способ заключается в культивировании S. mediolani в погруженной культуре, в культуральной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных элементов. В частности, микроорганизм культивируют на жидкой культуральной среде в аэробных условиях при температуре 24-37° С, предпочтительно при 27° С в течение 72-

160 час рИ можно варьировать в зависимости от среды от 6 до 8.

В качестве источника углерода могут быть использованы применявшиеся и ранее глюкоза, декстрин, крахмал, различная мука-- кукурузная, соевая, пшеничная, кукурузный настой и т. д..

Источником азота, помимо указанных выше источников углерода, содержащих также азот, могут служить казеин, размолотые семена хлопчатника, соли аммония и т. д.

Минеральные соли, пригодные для приготовления каротеноидов, вносят в зависимости от применяемой среды.

Например, могут быть применены обычно употребляемые хлориды, сульфаты или фосфаты натрия, калия, магния, цинка, меди н кобальта, карбонат кальция и др. Ферментацию можно выполнять лабораторно в колбах нли в промышленных ферментерах различпой мощности. По окончании ферментации мицелий отделяют от культурального бульона путем фильтрования или центрифугирования, а нигментные продукты выделяют нутем экстрагирования соответствующим органическим растворителем, смешивающимся или несмешивающимся с водой, таким как метанол, хлороформ, ацетон или метиленхлэрид. Разделение каждого продукта осуществляют с помощью хроматографии по известной технологии.

Продукты, полученные предлагаемым способом, были известны и ранее и применялись в зоотехники с целью нолучения яиц домашней птицы с более ярким желтком. Эти соединения дают птице в виде добавки к кормам. В данном случае может применяться мицелий, полученный в процессе ферментации, а не только чистые соединения.

Если применяют мицелий, выделенный из культурального бульона, то его высушивают в горячем воздухе или в вакууме и затем размалывают.

Полученный таким путем порошок тщательно неремешивают с обычными кормами. Количество пигментного продукта, добавляемое в нищевой продукт, может меняться в завнсимости от нужной пигментации и в соответствии с выбранным количеством натуральных пигментных элементов, предпочтительно оно может составлять от 0,3 до 6 г на 1 г{ кормов.

Пигментационное действие продуктов, .полученных предлагаемым способом, было определено по интенсивности цвега желтков, измеренной по колориметрической шкале «Roche (Mainguy P. et al).

Опыт был проведен на 30 курах-несущках семимесячного возраста, размещенных по отдельным клеткам и разделенных на три группы по 10 штук в каждой. Группа кур

Состав корма

1Основная диета, содержащая небольщое

количество общих пигментов, соответствующее 13,89 мг на 1 кг корма.

2Основная дпета-|-обезвоженная люцерна + общие пт1гменты 1500 иг на 1 ц смесн.

3Основная диета+мицелий с содержанием общих пигментов 1500 мг на 1 ц смеси.

Состав основной, диеты, вес. %:

гибридная кукуруза39,0

овес17,6

пшеничные отруби12,0

соевая мука 44%-пая15,0

мясная мука3,0

рыбная 3,0

концентрат дрожжей1,00

dl-метионин0,1

фосфат натрия0,7

карбонат кальц.ия6.30

хлорид натрия0,3

свиной жир1,0 фэркомплекс (фирменный

продукт)1,0

Фэркомнлекс - смесь витамннов и микроэлементов, нмеющая состав (на 1 кг смеси), г:

защищенный витамин А, м. ед750,000

Дз, м. ед150000

Е, Л1. ед.500

витамин В20,4

В120,0024

Кз0,1

Р2,5

фолиновая кислота0,015

d - кальция пантотенат1

dl - метионнн40

колннхлорид100

хлортетрациклингидрохлорнд2

иодин0,1

марганец7

цинк5

гидроксибутиотолуол10

неизвестные факторы ростадо 1,000

В уиомянутых груннах 2 н 3 обезвоженную

люцерну н мицелий заменили аналогичными

количествами пшеничных отрубей. Опыт, длившийся 30 дней, был разделен на два иериода;

нредэкснериментальный период (10 дней),

когда кормление нроводили в соответствии с

основной диетой, не содержащей люцерну;

экспернментальный период (19 дней), когда кормление проводили так, как онисаио выше. Во время экспериментального иериода и в последующие дпи была определена пигментация желтков. Результаты приведены в табл. 2. Следующие нримеры иллюстрируют изобретение.

Пример 1. Спорулированный слой десятидневной культуры S. mediolani, выросшей в пробирке на агаре-картофельно.м глюкозате при температуре 28° С, сняли и собрали в 4 мл стерилизованной дистиллированной воды. 0,5 мл этой суспензии испОоаьзовали для ннокулироваыия колбы, емкостью 300 мл, содержащей 60 мл среды следующего состава, %: декстрин4,0 казеин1,0 карбонат кальция0,5 сульфат аммония0,1 бикалийфосфат0,01 настой кукурузы1,0 сырая водадо 100 мл Стерилизацию нроводили нагреванием в ав токлаве ири температуре 190°С в течение 20 мин. После стерилизации рН среды соста вил 6,9. Колбу инкубировали при 28° С в тече ние 26 час на роторном вибраторе с числом оборотов 225 об1мин и ходом 3 см. 2 мл полу ченной таким нутем культуры использовали для инокуляции колбы емкостью 300 мл, со держащей 60 мл той же самой среды, стерили зованной так, как описано выше. Инкубацию нроводили в уже оииса нных условиях. После 120 час ферментации иолучили 500 мкг ниг ментных нродуктов на 1 мл культурального бульона. Таблица 2 Пример 2. Процесс такой же, как в при мере 1, с той лишь разницей,что взялн среду следующего состава, %: нерастворимый крахмал4,5 соевая мука2,25 кукурузный настой2,35 хлорид натрия0,5 карбонат кальция0,35 сырая водадо 100 мл. После 120 час ферментации получили 600 мкг пигментных продуктов на 1 мл куль турального бульона. Пример 3. Процесс такой же, как в нри мере 1, но среда имела состав, %: глюкоза мука из семян хлопчатника растворимый крахмал карбонат кальция сульфат аммония кукурузный настой до 100 мл сырая вода После 120 час ферментаНИИ получил 900 мкг пигментных нродуктов на 1 мл куль турального бульона. Пример 4. Процесс такой же, как в ири 3,0 соевая мука 0,2 меласса карбонат кальция 0,4 0,1 сульфат магния до 100 мл сырая вода После 69 час ферментации получили бОО.и/сг иигментных продуктов на 1 мл бульона культуры. Пример 5. Три колбы на 300 мл каждая, содержащие среду, онисанную в примере 1, инокулировали 25-дневной культурой, выраженной на среде и в условиях, оннсанных в нримере 1. Эти колбы инкубировали нрн темнературе 28°С в условиях, оиисанных в нримере 1. 170 мл культурального бульона, полученного таким образом, инокулировали в 3000 мл той же самой жидкой среды, содержащейся в нятилитровом ферментере, снабженном винтовой мешалкой, переливной трубкой для указания на киненне, барботером, трубкой для инокулирования, трубкой для отвода воздуха н термометром. Процесс осуществляли ири температуре 28° С со скоростью аэрации 3 м/мин и нрн перемешивании со скоростью 400 об/мин. Во время ферментации вспенивание регулировали путем добавления в малых количествах кремниевого иеногасителя. Максимальный выход пигментных продуктов получился через 77 час ферментации и составил 50 мкг на 1 мл культурального бульона. 10 л культурального бульона фильтровали 2%-иым Хаф)ле Суиерцел (торговое наимеиованне), фильтрат отделили. Мицелий суспендировали при комнатной температуре в 3 л метанола и взбалтывали. Затем каждый раз экстрагировали 3 л смеси метанола с хлороформом (1:1). Объединенные экстракты повторно иромывали водой и выделенный хлороформенный слой высушивали через сульфат натрия н выиаривали в вакууме ири 35°С. Темио-красиый масляиистый осадок состоит из комнлекса иигментов - изорениератенов. Этот осадок отбирали нетролейным эфиром (300 CMi). Вес красно-коричневой массы, отделенной фильтрованием, составил 1,5 г. Маточные эфирные растворы концентрировали до 100 мл и хроматографировали на колонке с нейтральной окисью алюминия сначала элюированием иетролейиым эфиром, чтобы удалить жиры, затем петролейиым эфиром, содержащим 1 % ацетона. Элюат из большого верхнего слоя концентрировалн в малом объеме и выдерживали ночь в холодильнике. Выделили 400 мг пурпурно-красного кристаллического нродукта с точкой плавления 200- 201°С; максимальная адсорбция в видимом сиектре при следующих длинах золи (фракция А): растворитель л.макс , W.W (428), 448, 479; петролейный эфир бензол(440), 465, 495.

зол) и Rf 0,38 (петролейный эфир с 1% ацетона). Эта фракция А поэтому были индентифицирована как изорениератец путем хроматографического и спектрографического сравиеция и по точке плавления в смеси с образцом, приготовленным путем синтеза. Осуществляя элюирование колонки петролейным эфиром, содержащим 10% ацетона, собрали второй слой; из элюата, сконцентрированного до малого объема, получили 200 мг кирппчно-красного порошка, плавящегося при температуре 180-185° С, имеющего максимум адсорбции в видимом спектре при следующих длипах волн (фракция В):

м

HJJ

(425), 446, 475; (438), 463, 493.

Путем хроматографии па топком слое сплпкагеля получили: Rf 0,47 (бензол) и ,7 (метилеихлорид). Указанная фракция В мало растворима в обычных органических растворителях, хотя опа растворима в спиртовом растворе карбоната натрия, окрашиваясь при этом в ярко-красный цвет, и повторно осаждается подкислением.

При обработке указанным ангидридом в ппрпдипе она дает феколацетат (v КВг 12,15, 17,58), нерастворимый в спиртовом растворе карбоната натрия.

Указанная фракция была идентифицирована с 3-оксиизорениератеном путем хроматографического и спектрометрического сравнения и по точке плавления в смеси. Красно-коричневую массу (1,5 г), первоначально собранную из летролейного эфира, хроматографировали па колонке силикагеля и элюировали бензолом, содержащим 10% ацетона. Из большого нижнего слоя путем выпаривания растворителя и

последующей обработки петролейным эфиром получили 600 мг кирппчно-красной аморфной массы, плавящейся при температуре 200°С (с разложением), обладающей макспмальной адсорбцией в видимом спектре ирп следующих длинах воли (фракция С):

макс ; W.U

(425), 446, 475; (438), 463, 493.

Путем хроматографии на тонком слое силикагеля получили: Rf 0,l (бензол) и Rf 0,26 (метиленхлорид).

Указанная фракция С была идентифицирована с 3,3-диоксипзоренператеиом путем хроматографического и спектрографического сравнения и по точке илавления в смеси.

Предмет изобретения

3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что изорениератен п его 3-окси-3,3-диоксипроизводные экстрагируют органическим растворителем и очищают путем хроматографии.