Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности производству антибиотиков,
Антибиотик А 42125 проявляет антимикробную активность в отношении микроорганизмов, продуцирующих метан. Антибиотик повышает эффективность питания, промотирует рост жвачных животных.
Продуцентом антибиотика является штамм Nocardia aerocolonigenes A 42125, который выделен из почвенного образца из Бразилии. Штамм депонирован под номером NRRL 18049 и характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки,
Культура продуцирует экстенсивный субстрат и хорошо развитый воздушный
мицелий. Воздушные гифы имеют вид па- утинны. Конидиинаблюдают при помощи растровой электронной микроскопии. Споры образуются слабо и нерегулярно. Орнаментация поверхности спор гладкая. Форма спор от продолговатой до цилиндрической, образуют цепи из более чем 50 единиц. Размер спор варьирует от 1,2-0,9 х 0,5-0,4 мкм, в среднем 1,1х х 0,5 мкм. В условиях глубинного роста со встряхиванием гифы разделяются на фрагменты.
Среда МПС2 - рост обильный, субстратный мицелий 78.d.yBrI (здесь и далее цвет приведен в системе Tresner и Bachus); воздушный мицелий обильный, 5fel.gy.rBn. Растворимый пигмент светло-коричневый .
сд
1 J
Среда МПСЗ - рост хороший, субстратный мицелий 89.p.Y4; воздушный мицелий обильный, ь, , жемчужно-белый. Растворимый пигмент отсутствует,
Среда МПС4 - рост хороший; субстратный мицелий 77.rn.yBr; воздушный мицелий хороший, светло-серый. Растворимый пигмент отсутствует.
Среда МПСЗ - рост обильный; субст- Ю ратный мицелий 77,m.yBr5; воздушный мицелий обильный, жемчужно-белый. Растворимый пигмент отсутствует.
Малат кальция - рост хороший; субстратный мицелий 77.rn.yBr; воздушный 15 мицелий хороший, Ь , жемчужно-белый. Растворимый пигмент отсутствует.
Агар с раствором Чапека - рост хороший; субстратный мицелий 77.rn.yBr; воздушный мицелий хороший, d, светло-20 серый. Растворимый пигмент слабо светло-коричневый .
Глкжозо-аспарагиновая среда - рост хороший; субстратный мицелий 89,p.Y; (Воздушный мицелий слабо развитый, d, 25 светло-серый. Растворимый пигмент отсутствует.
Агар с водопроводной водой - рост хороший, субстратный мицелий 92.у white 8; воздушный мицелий обильный, 30 |Ь, жемчужно-белый„ Растворимый пигмент отсутствует,
i Дрожжево-декстрозный агар - рост обильный, субстратный мицелий 78,d.Br ; воздушный мицелий не развит (морщини- стая поверхность.). Растворимый пигмент светло-коричневый.
Физиолого-биохимические свойства.
Разлагает казеин, эластин, гуанин, гкпоксантин, тирозин,40
Гидролизует малат кальция, ДНК, эскулин и крахмал.
Сбраживает до кислоты арабинозу, целлобиозу, фруктозу, галактозу, cf- 45 метил-Д-гликозид, глюкозу, глицерин, инозит, лактозу, мальтозу, маннит, маннозу, мелибиозу, рафинозу, рамно- зу, трегалозу, ксилозу.
Утилизирует ацетат, бензоат, цит- ,-Q рат, малат, оксалат, пропионат, пи- руват, сукцинат и тартрат.
Продуцирует каталазу, фосфатазу, протеинаэу, уреазу, меланоидные пигменты,с г
Устойчив к концентрации NaCl до 6%.
Гидролизует латекс без сливок.
Восстанавливает нитраты в нитриты.
Растет при температуре от 15 до 37°С, погибает при воздействии темпе ратуры 50°С в течение 8 ч.
Устойчив к лизоциму, цефалотину, гентамицину, линкомицину, пенициллину и тобрамицину, чувствителен к ри- фампину.
Способ получения антибиотика А 42125 иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Биосинтез антибиотика.
Штамм Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 в виде лиофилизироваьной гранулы или суспензии, сохраняемой в жидком азоте, высевают на скошенный агар следующего состава, г/л: Картофельный декстрин 10 Дрожжевой экстракт 1 Ферментативный гидролизат казеина2Мясной экстракт 1 Cod,- 6H70 0,01 Агар20 Деионизированная -. вода, л1
рН регулируют от 6,2 до 7,0 с помощью раствора NaOH.
Инокулированный скошенный агар инкубируют при 30°С в течение 7 дн. Зрелую культуру на скошенном агаре соскабливают стерильным инструментом для разрыхления спор и извлечения и мацерации мицелиальной пленки. Около 1/4 разрыхленных спор и полученную таким образом культуру используют дл инокуляции 50 мл вегетативной среды, имеющей следующий состав, г/л: Глюкоза15
Маниочный декстрин 20 Трупа сои культурной1 5 Кукурузная мерсе- ризационная жидкость 10 Дрожжевой экстракт 1 СаС03 2 Водопроводная вода, л 1 Инокулированную вегетативную сред инкубируют в 250 мл колбе Эрленмейер при 30 С приблизительно 72 ч на ка- чалке со скоростью 250 об/мин.
Эту инкубированную вегетативную среду (1,25 мл) используют для иноку- лирования 50 мл продуктивной среды, имеющей следующий состав, г/л: Глюкоза25
Кукурузный крахмал 10
10
4 5
0,5 2,0
1
51
Растворимый мясной
пептон
Ферментативный гидролиз ат казеина
Сырая меласса
MgSCV 7Н20
СаС03
Минеральная смесь
Чапека мл
Деионизированная во ,
Да, л
Минеральная смесь Чапека имеет следующий состав: 100 г КС1, 100 г MgS04 7H.jO, 2 г FeS04- 7Н40, до 1 деионизи рованной воды.
Инокулированную продуктивную среду инкубируют в 250 мл широкогорлой колбе Эрленмейера при 30°С в течение периода от 3 до 5 дн на качалке со скоростью 250 об/мин.
Для того чтобы получить большой v объем инокулянта,, 10 мл инкубирован ной вегетативной среды, полученной, как описано выше, используют для ино кулирования 250 мл двухстадийной среды для выращивания, имеющей такой же состав, что и вегетативная среда. Эт двухстадийную среду инкубируют в 2-литровой широкогорлой колбе Эрленмейера приблизительно 70 ч при 30°С на качалке со скоростью 250 об/минs
Полученную таким образом инкубированную двухстадийную среду (400 мл) используют для инокулирования 100 л стерильной продуктивной среды, полу-: ченной, как описано выше. Брожение проводят в 165-литровом бродильном чане в течение периода от 3 до 5 дн при 30°С в условиях перемешивания. Низкий расход воздуха (0,12.- 0,25 об/мин) и умерененная скорость вращения (200-250 об/мин) в мешалке поддерживают уровень растворенного кислорода на 30% выше воздухонасыще- ния.
Пример 2. Выделение антибиотика А 42125.
Весь ферментационный бульон (92 л содержащий 3% Hyflo Supercel, фильтруют через фильтр-пресс. Бульонный фильтрат (74 л) доводят до рН 7 посредством NaOH. Прибавляют смолу Диа- ион НР-20 (9,4 л). Смесь перемешиваю в течение 45 мин и отфильтровывают. Фильтрат удаляют и смолу промывают 3 раза.водой (каждый раз 10л) и три раза смесью ацетопитрилгвода (каждый раз 10 л), ресуспендируя, пе
10
77
15
20
5
0
5
0
5
0
5
106
ремешивая и фильтруя. Промывки удаляют. А 42125 элюируют, суспендируя, смолу в смеси ацетонитрилгвода (1:1, 10.л) перемешивая и фильтруя. Осуществляют четыре последовательных элюи- рований, и каждую фракцию элюата анализируют с использованием метода дисков Micrococcus luteus для количественного определения антибиотика. Первые два элюата объединяют, концентрируют в вакууме для удаления ацетонит- рила и сушат вымораживанием с получением 94,9 г сырого А 42125. Из третьего элюата получают 20,8 г сырого А 42Г25.
Пример 3. Очистка и кристаллизация А 42125.
Неочищенные препараты А 42125, полученные в примере 2, объединяют (115,2 г) и растворяют в воде (3 л). Раствор фильтруют для удаления осадка и фильтрат подводят к колонке, содержащей 3 л Dowex 50 х 2 (NH), 100 - 200 меш.смола. Колонку промывают последовательно пятью объемами колонки воды и 0,1 н. раствором NH4OH. Фракции от элюирования 2 н. МНЧОН,содержащие наибольшие количества А 42125, объединяют и концентрируют до объема около 3 л П 42125 осаждают и разделяют фильтрацией. Осадок растворяют в метаноле (300 мл) и этот раствор прибавляют к эфиру (6 л) для осаждения А 42125. Этот осадок фильтруют и сушат с получением 16,6 г А 42125 в виде аморфного порошка. Второй осадок получают последующей концентрацией водного раствора и обработкой его аналогичным образом с получением 20,7 г менее чистого А 42125.
Первый А 42125 (16,6 г) растворяют в теплой воде (800 мл). Этот раствор отстаивают в течение ночи при комнатной температуре и А 42125 кристаллизуют. Кристаллы разделяют фильтрацией и сушат в вакууме с получением 10,6 г и 2,3 г (второй сбор) кристаллического А 42125.
Характеристика антибиотика.
Состояние: белые кристаллы (из воды) .
Т.пл.: 149-150сС.
УФ: поглощение отсутствует.
ИК (КВч): показывает поглощение при следующих частотах () - широкий пик, который включает 3423, 3413, 3409, 3403, 3398 и 3386; 2937, 1720, 1602, 1453, 1408, 1379, 1290, 1192,
1120, 1090, 1064, 971, 870, 830 и 802.
Титрование (80%-ный водный диметил- формамид): степени кислотности 5,2, 8,7 и 10,5.
Мол.масса: 2032 (масс-спектромет- рия полевой десорбции).
Эмпирическая формула: С 101К (g4N2U3,
Элементарный анализ: углерод 59,51, водород 9,05, азот 1,44, кислород 30,08.
Аминокислоты не обнаружены.
Растворимость: растворим в воде.
Биоавтография: с использованием ватманской бумаги № 1, пропитанной 0,95 Н Na.,S04 и NaHSO,,, системой
растворителя - 80%-го водного этанола, содержащей 1,5% NaCl, с помощью тест-культуры Microcoecus luteus, найдено, что Rf приблизительно 0,46.
На основании характеристик титрования антибиотик может содержать карбоксильную группу, фенольную группу, .которые могут образовывать соли - натриевые, калиевые,, литиевые, цезиевые, рубидиевые, бариевые, кальциевые и магниевые; аммониевые, первичные, вторичные и третичные С -С -алкилам мониевые и окси-Сг-С4 алкиламмоние- вые; аддитивные соли, образованные стандартными реакциями как с органическими, так и неорганическими кислотами.
Для корма скота может быть использован не только чистый антибиотик, но и вся культуральная жидкость без экстракции или разделения, после отделе- ния воды, т.е. обезвоженная культуральная жидкость. Высушенную различными способами культуральную жидкость перемешивают с питательным премиксом
П р и м е р 4. Рацион крупного ро- гатого скота, усиленный А 42125.
Сбалансированный рацион с высоким содержанием зерна, предназначенный для скота, готового к переработке, получают по следующему рецепту, %: Кукуруза, желтая 50,25 Стержни кукурузного початка 34,927 Люцерновая мука, дегидратированная, 17%4,00
Соевый шрот, экстрагированный растворителемМочевина, кормовой сорт Меласса тростнико- восахарная Дикальцийфосфат Соль Карбонат кальция Микроэлементный минеральный премикс Премикс Витамин А и д Премикс Витами- н Е Антибиотик А 42125
100,00
Микроэлементный минеральный премикс содержит, %: 2,50 марганца в виде окиси марганца, 0,07 йода в виде йодида калия, 0,03 кобальта в виде карбоната кобальта, 0,5 меди в виде окиси меди и 20 цинка в виде сульфата цинка.
Использование способа позволяет получить новый антибиотик, который проявляет активность в отношении микроорганизмов, продуцирующих метан, что повышает эффективность питания животных и промотирует рост у жвачных животных. Формула изобретения
1.Способ получения антибиотика А 42125, заключающийся в том, что штамм NocardHa aerocolonigenes NRRL
18049 культивируют в анаэробных глубинных условиях при перемешивании в питательной среде, содержащей источник углерода и азота и минеральной соли, с последующим выделением целевого продукта из культурадьной жидкости.
2.Способ по п.1, отличающий с я тем, что, с целью получения чистого препарата, культуральную жидкость фильтруют, а фильтрат подвергают экстракции и очищают целевой продукт хроматографическим методом.
3.Штамм микроорганизма Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 - продуцент антибиотика А 42125.
Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Антибиотик А 42125 получают путем культивирования штамма NOCARDIA AEROCOLONIGENES NRRL 18049 в анаэробных глубинных условиях при перемешивании в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли. Целевой продукт может быть использован в виде обезвоженной культуральной жидкости либо в виде чистого антибиотика. Для этого отделяют жидкую фракцию культуральной жидкости, полученный фильтрат подвергают экстракции и очищают антибиотик хроматографическим методом. Эмпирическая формула C101H184N2O38, элементарный анализ, % : C 59,51
H 9,05
N 1,44
O 30,08. 2 с. и 1 з.п. ф-лы.
