Способ получения азотсодержащего антибиотика Советский патент 1976 года по МПК C12D9/14 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЗОТСОДЕРЙСЛиШГО

АНТИБИОТИКА 517 четко выраженной массой вертикальньиГ гиф мицелий образует компактный слабо поднимающийся жесткий (кожеподобный) рост, в колониях с корЬткими гифами ми. целий образует куполоподобный рост. Воз« душг-1ые гифы не образуются ни в какой ; среде. На поверхности куполообразных кй ; лоний образуется большое количество спо« ; рангий. Спорангии образуются в избытке на по лусинтетическом агаре А ШО4 енссена. Они появляются через 2--4 недели инкубации при IT-IQ C. CnopatiTHsi находится отдель-но на очень коротких спорангиофорах. Спо« |рангий может иметь сферическую, субсфери- ческую или слегка лопаст 1ую форму, сравни тельно невелик, диаметром 4«10 мкм, Спорангий содержит субсферкческих спорангиоспор, расположекеьй в виде одного или нескольких витков в спораш-ии, Cnopak гиоспоры имеют примерно 1 мкм в диаметр в зрелом состоянии. Растрескивание; споран« гия означает полную или частичную де. зинтеграцию спорангия. Через мин после помещения в, воду спорал-тгий начинае набухать, приобретая типичную сферическую форму, и затем выделяет споры при дезин теграции стенок. Внец..,.,, Агаровая среда Чапека, Хороагий рост. В точке инокуляи.ки зуется колония диаметром 0:75 см за 4 недели. Воздушных гиф кет Колония но плоская с небольшим цеатральным пиком Цвет колонии умеренно оранмсевый. Споран гии наблюдаются лишь в редких случаях, Пептоно агаровая среда Чапека. Хороший рост, В точке инокуляции об-, разуется колония диаметром около 1,0 см за 4 недели. Отсутствие воздушных гиф. Колония слабо растет и несколько свертывается или . становится шишкообразной. Цвет колонии от красновато--бурого до , |ричнево 1оранжевого. Спорангии не образу-ются. Агар Анио-Генссена. Отличный рост. В точке инокуляции образуется колония диаметром 0,5 см за 4 недели. Отсутствуют воздушные гифы. Колония имеет круглую, крестообразную или звездообразную форму с понижением или расселиной в пентре. Спорангии образуются в большом количестве в колониях, инскубиро ванных при С, в небольшом количестве в колониях, инкубированных при более высоких температурах. Продуцент антибиотика AktingpLQnes jхранится в коллекции культур сельскбхоаяй 4.. : ственной научно-исследовательско1й службы, Северное отделение изучения питательнызГ веществ, департамента сельского хозяйства, США Пеория, Иллинойс 61604, за номером IVRKL 5462. Культуральная среда, на которой выращивают культуру А. /i/.. , содержит глюкозу (источник углерода), соевую муку (источник а&ота) и неорганические соли, содержащие ионы натрия, калия, аммония, кашчция, фосфаТ, хлорид-, сульфат- и аце тат.ионы). Для получения лучших результатов в культуральную среду вносят дрожжевые экстракты. рН культуральной среды 6,5-7,3. Для продушфования антибиотика в болЬь ших количествах используют глубинную аэробную ферментацию в больших танках. Небольшие количества антибиотика получают в матрицах каналкахо Вегетативный инокулум получают инокуляцией небольшого; объема культуральной среды спорами или фрагментами мицелия, полученную свежую активно растущую культуру микроорганизма (вегетативный инокулум) переносят в большой танк. Среда, используемая для выращивания вегетативного инокулума, может быть такой же, как и для выращивания антибиотика в больших количествах. Продуцент антибиотика можно выра01И-. i вать при , предпочтительно при 30°С, При аэробной глубинной ферментации стерилизованный воздух пропускают или продувают через культуральную среду. Для. роста микроорганизмов и продуцирования антибиотика подают в танк 0,1 объема воздуха в 1 мин на 1 объем культуральной среды. Максимальное продуцирование антибио-. тика наблюдается в течение дней в большом тайке или колбе-качалке, Антибиотик извлекают из культуральной среды и отделяют от других присутствуюишх веществ методом экстракции или адсорбции. В качестве экстрагента используют хлороформ, который хорошо растворяет антибиотик, выделяемый из подщелоченной культуральной среды. Для . дальнейшей очистки антибиотик хромато графируют, например, на угле, полиамидной смоле, силикагеле, сефадексе Н-2О, амберлите Хао П р и м е р д,1. Ферментация антибиотика в колбе-жачалке. Приготовленную культуру А, fH. NRRL 5462 выдерживают на косом агаре следую щего состава: Стерипизованнная сухая овсяная мука, г Сухие пивныедрожжи (без горечи), г Гидрофосфат калия . Минеральная среда Чапека, мп 1100 л Агар, мл Минеральная среда Чапека состоит из 2 г сульфата железа Ре SO ; (раствор в 2 мп концентрированной соляной кислоты), 10О г хлорида калия КС1 I 100 г сульфата магния М О 1и до 1 л обессоленной воды. К среде ;(рН 6,2) добавляют едкий натр до рН 7, ; и стерилизуют в, аътоклаве 30 мин при :120°С (рН 6,7). Косой агар икокулируют А.. A/RRL 5462 и инкубируют 10-14 д-ней при 30°С. В указанной среде культура обычно не образует спор. Поэтому необходимо Пле ку мицелия промацерировать плоской за остренной инокулирующей иглой для увепи чения числа потенциальных центров роста Мацерированную зрелую культуру покрьгоают бычьей сывороткой и аккуратно царапа стерильным стержнем для получения миделиальной суспензии, которую переносит i6 пробирок для лиофилизации, Лиофилизат из какой-нибудь пробирки используют для инокуляции 50 мл вегетативной среды, со держащей (г); Глюкоза Картофельный крахмал Соевая мука Обезжиренная мука из семени хлопчатника Карбонат кальция Вода, л i Инокулированную вегетативную сред ;в колбе на 250 мл инкубируют 72 час п , на ротационной качалке (250 об/м отбирают 1О мл инкубированной вегетати ной среды и инокулируют 200 Mjf вегетат |ной среды второй стадии. Среду (второй стадии) в колбе на 1л инкубируют 24 ч ,при ЗО С на ротационной качалке (250 ). Пример 2. Ферментация антибио i ка в танке., I 200 МП. полученной вегетативной среды .второй стадии (см. пример 1) используют iдля инокулирования 25 д стерильной про- I дуцентной среды, содержащей (%): 8 .- 5,0 Глюкоза Картофельный крахмал Меласса Растворик ый мясной пептон Казеин, гидролизованный ферМёнтативно Соевая мука Сульфат магния Карбонат кальция Антивспениватель Вода,л рН среды после стерилизации в автокпаве при 12ос в течение 30 мин равен 6,4. Инокулированную среду оставляют в фермен.тере емкостью 40 л на 4 пня при 30 С. Ферментационную среду аэрируют стерилизованным воздухом из расчета 0,5 объема , воздуха на 1 объем культуральной среды IB 1 мин. Ферментационную среду перемешивают обычной мешалкой (4ОО об/мин). I Пример 3. Выделение антибиотика. Всю ферментационную жидкость (бульон) |из танка емкостью 25 л отфильтровывают, добавляют к фильтрату 2 н. едкий натр до |рН 8,5, экстрагируют 2/3 объема хлоро|форма, упаривают экстракт в вакууме до небольшого объема и медленно при переме(шивании приливают .к 20 обьемам петрол йнрго эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, сушат в вакууме и получают 3,13 г неочищенного антибиотика. Неочищенный антибиотик растворяют в 100 мл этилацетата, пропускают через колонку с основным гтшоземом, промывают колонку ЗОО мл этилвцетата, элюируют смесью этилацетат « этанол (19:1), фракции, содержащие антибиотик объединяют, упаривают, досуха в вакууме, растворяют остаток в небольшом количестве хлороформа, приливают к 2О обьемам петролейного эфира, отфильтровывают осадок, сушат в вакуу|Ме и получают 1,63 г аиг(1биотика. Пример 4. Проводят опыт, как в .примере 3, осаждают антибиотик петролей- ,ным , 5 г выделенного продукта растворяют в 10 мп этилацетата и доста ТОЧНОМ количестве метанола, чтобы полу чить тфозрачный раствор, пропускают раст:вор через колонку с 300 г силикагеля в этилацетате, промывают колонку 2,5 л атилацетата до удаления примесей и элюи- руют антибиот;пс смесью этилацетат - это,нол (95:5). Активные фракции объединяют, : упаривают досуха в вакууме н получают 2 г-белого порошкообразного антибиотика, |При дальнейшем элюироваиии дополнитель 517265

8.

но выделяют 0,8 мг антибиотика в виде

светпо)нелтого порошка.,«..---

- формула и а о 6 р е т в „ и я выращивают на среде, содержащей

.. Способ получения йзотсодержашего ан- Т ™У Рода, азота и неорганический

ибиоттпса, о т ли чающийся тем,j . ивыделяют целевой извести что 19 льтуру AcUftopUnes fiupplertsis NRRL Гйьшиприемами.