О- - ,1КЧРд'l/trt«Рихтер Гедеон Ведьешети Дьяр Р.Т.»^ -'^--^-^-^i^A):(Венгерская Народная Реснублика)>&,-«,>&.?*;??}1?1ека f/i&A Советский патент 1972 года по МПК C12P33/02 

Изобретение относится к областн медицины и касается получения кортикостероидов.

Известен снособ получения кортикостероидов при помощи культур Arthrobacter или Corynebacter, обладающих индуктивной стероид-1,2-дегидрогеназой, индукцию которой вызывают стероида.ми типа андростана или прегнана. Однако при использовании этого способа выход продукта низкий, а чистота его не удовлетворяет требованиям фармакопеи.

Целью предлагаемого способа является ускорение процесса и повышение выхода целевого продукта.

Для достижения поставленной цели индукцию фермента стероид-1,2-дегидрогеназы проводят в Период стационарной фазы культур1л прибавлением 0,02-0,2 мг/мл стероида индуктора с одновременны.м провоцированием вторичного размножения бактерий путем введения в культуральную среду 0,01-0,1% источника углерода или азота, носле вторичного исчерпания нитательных ресурсов среды добавляют 1,2-насыщенный кортикостероид и осуществляют дегидрирование, а конечный продукты выделяют известными приемами.

Стероид нрибавляют в форме грубых кристаллических зерен, в виде водной суспензии или кристаллов, осажденных из органического растворителя небольшим количеством воды.

да прибавляют моио- или дисахариды. В качестве источника азота добавляют аминокислоту или питательное вещество, содержащее аминокис.лоту, например, кукурузный экстракт. В начале индукционного периода прибавляют аммониевую соль органической кислоты, например, сукииоиат ам; 1ония.

Нример 1. 5 л стерильной питательной среды, рН 6,8-7,0, содержащей 0,5% глюкозы, 0,3% сукционата амлюния, 0,1% экстракта дрожжей и 0,1% дегидрофосфата калия, ннокулируют суснензией Corynebactcrium clems, и культуру инкубируют при 35°С при перемеН1ивании и аэрации со скоростью 80 .лгЛ кислорода на 1 .2 среды в час. Культивирование ведут до иолного израсходования сукционата аммония (около 14 час). К культуре прибавляют 0,5 л стерильного раствора, содержащего 0,8% сукционата аммония. В этом стерильном растворе предварительно суспенднруют 0,5 г гидрокортизона. Культуру ннкубнруют 5 час. Количество клеток возрастает на 20%.

Нример 2. 250 M.I нитательной среды, содержащей 0,4% глюкозы, 0,4% пептона, 0,4% экстракта дрожжей, стерилизуют в конической колбе Эрленмейера, объемом 750 хл. Среду инокулируют жидкой культурой Arthrobactei simplex, и культуру инкубируют при встряхивании при 35°С до начала периода покоя клеток. Эта стадия наступает примерно на 18-

20 час культивирования. 0,2 г глюкозы растворяют в 10 ли воды, а 10 мл предпизолона (индуктор-стероид) растворяют ъ2мл метанола. Оба раствора объединяют и прибавляют к культуре, после чего инкубирование ведут

4час. По окоичании этого периода активность культуры составляет 180 ед/.«л. Получеппую культуру прибавляют к 4750 мл етерильной воды и 1,6 л/г, т. е. 8 г гидрокортизона, дегидрируют получеиной разбавленной культурой в

5л. Гидрокортизон вводят в аппарат для ферментации в форме раствора в метаноле, содержащего 10% хлористого кальция. Раствор прибавляют четырьмя равными порциями через каждые 2 час. Инкубироваиие ведут при 35°С при перемешивании и аэрации ео скоростью 80 мМ кислорода и а 1л среды в час. Через 8 час инкубации проводят хроматографию, среда не содержит гидрокортизона. Культуральную жидкость экстрагируют тремя порциями этилацетата, сушат и выпаривают. Получают 7,1 г кристаллического преднизолона, содержаш,его 1,0% остаточной примеси гидрокортизона.

Пример 3. 200 л питательной среды, рП 6,8-7,0, содержащей 0,5% глюкозы, 0,1% аспарагина и 0,2% кукурузного экстракта стерилизуют, инокулируют 10 л культуры Arthrobacter simplex и инкубируют при 35°С при перемешивании и аэрации со скоростью 120 мМ кислорода на 1 л среды в час. Через 14 час еодержание аминокислот в культуре составляет меньше 0,02%.

25 г гистидина растворяют в 1000 мл воды, а 25 г гидрокортизона (индуктор - стероид) растворяют в 300 мл метанола, содержащею 10% хлористого кальция. Растворы объедиияют и прибавляют к культуре. Индукцию ведут

3час. Активность культуры составляет 420 едМл. Скорость превращения гидрокортизона равна 58у мл/мин.

Культуру, содержащую стероид-1,2 - дегидрогеназу, разбавляют водой в соотношении 1:20 и к 4000 л полученного бульона прибавляют 3,2 кг гидрокортизона, через 2 час добавляют еще 1,6 кг гидрокортизона. Общее количеетво прибавленного гидрокортизона составляет 1,2 г/л. Продолжают инкубирование, через три часа отбирают пробу и исследуют методом хроматографии. Гидрокортизон отсутствует. Культуру экстрагируют тремя норциями по 0,5 объема хлороформа, экстракты обецвечивают обычным способом, выпаривают в вакууме; продукт кристаллизуют, фильтруют и сущат. Получают 4,2 кг преднизолона.

Пример 4. 4 кг гидрокортизона суспендируют в 16 л воды, еодержащей 100 г эмульгатора «Твин - 80. К суспензии прибавляют

4л метанола, суспензию переноеят в аппарат для гомогенизации и прибавляют к культуре, содержащей стероид-1,2-дегидрогеназу, получение которой описано в примере 3. 20 г/л гидрокортизона подвергают превращению. Во втором и шестом часу превращения прибавление прерывают на 1 час для исследований. Превращение ведут при 35°С при перемешивании и аэрации со скоростью 80 мМ кислорода иа 1 л среды в час. Когда зерна гидрокортизона исчезают и начинают преобладать игольчатые к)иеталлы преднизолона, исследуют культуральную жидкость методом хроматографии. Ферментацию прекращают, когда количество остаточного гидрокортизона составляет не более 2% (приблизительно через 10-12 час). Кристаллический преднизолон отделяют, растворяют в смеси хлороформа с метанолом, раствор фильтруют, обесцвечивают 100 г активированного угля, выпаривают в вакууме, продукт кристаллизуют. Получают 3,45 г преднизолона, который содержит 1,8% остаточного гидрокортизона.

Пример 5. Штамм Curvularia prasadii культивируют 24 час в питательной среде, содержащей 1,5% глюкозы и 2,5% экстракта кукурузы. К культуре прибавляют раствор 6 г соединения Рейхштейна-S (RS) в 60 мл метанола, содержащего 10% хлористого кальция. Культуру инкубируют при при перемешивании и аэрации со скоростью 80 лШ кислорода на 1л среды в час. Исследуют методом хроматографии через 4 час. Через 28 час, когда соединение RS полностью превратилось, пробу исследуют методом хроматографии на бумаге. Фильтруют, к фильтрату, после индукции описанной в примере 3, прибавляют 300 мл культуры Arthrobacter simplex. По данным хроматографии основным компонентом фильтрата является гидрокортизон. Культуру инкубируют, как описано в примере 3, и процесс превращения контролируют методом хроматографии. Продукт выделяют как в примере 3 и получают 3,1 г преднизолона.

Пример 6. 500 мл стерильной питательной среды, содержащей 0,3 % глюкозы и 0,3% пептона инокулируют культурой Arthrobacter simplex, культуру инкубируют при 35°С при

встряхивании до наступления периода покоя (примерно 20 час). К культуре прибавляют 0,25 г глюкозы и 0,15 г глицина и индукцию провоцируют прибавлением 100 лгг 17-а-метилтестостерина, растворенного в 10 мл метанола.

Культуру инкубируют при 35°С при встряхивапии. Активность стероид-1,2-дегидрогеназы через пять часов инкубации составляет 220 едАмл.

500 мл культуральной жидкости разбавляют

4500 мл воды и прибавляют раствор 4 г соедипения RS в 50 мл .метанола, содержащего 100 г хлористого кальция. Дегидрирование проводят при перемешивании и аэрации до потреблеиия субстрата (примерно 16 час). Процесс превращения контролируют методом хроматографии. Культуральную жидкость экстрагируют тремя порциями по 0,3 объема этилацетатом и выделяют продукт известными приемами. Выход 3,28 г 1-2-дегидросоедине5Предмет изобретения

1. Способ получения кортикостероидов при помощи культуры Arthrobacter или Согупеbacter обладающих индуктивной стероид-1,2дегидрогеназой, индукцию которой вызывают стероидами тина андростана и ирегнана, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса и повыщенил выхода целевого продукта, индукцию фермента стероид-1,2-дегидрогеназы проводят в период стационарной фазы культуры прибавлением 0,02-0,2 мг/мл стероида индуктора с одновременным провоцированием вторичного размножения бактерий путем введения в культуральную среду 0,01 - 0,1% источника углерода или азота, после вторичного исчерпания питательпых ресурсов среды добавляют 1,2-насыщенный кортпкостсроид и осуществляют дегидрирование, а конечный продукт выделяют известными приемами.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что стероид прибавляют в форме грубых кристаллических зерен, в виде водной суспензнп или кристаллов, осажденных из органического растворителя небольщим количеством воды.

3.Способ по п. 1, orлuчaюu uйcя тем, что к культуре в начале индукционного нериода

прибавляют мопо- или дисахариды.

4.Способ по п. 1, отличающийся тем, что к культуре в начале индукционного периода добавляют аминокислоту или питательное вещество, содержащее аминокислоту, например,

кукурузный экстракт.

5.Способ но п. 1, отличающийся тем, что к культуре в начале индукционного нериода прибавляют ам.мониевую соль органической кислоты, нанример, сукционат аммония.