ВСЕСОЮЗНАЯ I Советский патент 1972 года по МПК C12P17/04 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА

Изобретение относится к способу получения антибиотиков и антибиотических комплексов.

Известен способ получения антибиотического комплекса, содержащего гризеофульвин, состоящий Б культивировании микробиологического штамма-продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в том числе содержащей углеводород, в аэробных условиях с последующим выделением комплекса из культуральной среды.

Используемый углеводород содержится преимущественно во фракциях минеральных масел, например нефти, сланцевого или угольного дегтя. Он может представлять собой керосин, газойль смазочные масла, экстракты, полученные при регенерации смазочных масел.

Углеводород обычно состоит из смеси углеводородов, содержащих не менее 10 атомов углерода.

В качестве источников углерода можно использовать моносахара, молочную сыворотку, мелассу, кукурузную барду, соевую муку, хлопковый жмых и т. д.

Источниками азота служат азотнокислый калий, азотнокислый аммоний, аммиак, мочевина, автолизат и гидролизат дрожжей, соевая мука, хлопковый жмых и т. д.

фитопатогенных микроорганизмов культивирование продуцента осуществляют в две стадии с использованием в качестве продуцента в первой стадии дрожжей рода Candida, в частности С. tropicalis и С. lipolytica, а во второй стадии - плесневых грибов рода Penicillium, в частности Р. grseofulvum-ATCC 11855 и Р. nigricans-ATCC 9439, и выделяют антибиотический комплекс в виде углеводородной

0 фракции, содержащей антибиотик, с добавлением при необходимости в культуральную среду дополнительного количества углеводорода. В первой стадии соотношение между углеродом и азотом в питательной среде составля5 ет обычно не меньше 20: 1, нреимущественно 10 : 1 а во второй стадии - не меньше 80 : 1, рН на первой стадии 4,5-5,0, на второй 5-8. Используемый углеводород выделяется вместе с микроорганизмом первой и второй стадии таким образом, что микроорганизм на первой стадии способен метаболизировать только лишь часть углеводорода, а на второй стадии способен метаболизировать по меньшей мере ту часть углеводорода, которая не была мега5 болизирована ранее.

Антибиотик растворяется в углеводороде используемом в качестве растворителя, способного растворить более 1 мг культуры на 1 л раствора, преимущественно О ,001-5 г/л и

Потребление углеводорода микроорганизмом при определенных условиях реакции может быть таким, что незначительное количество остаточного углеводорода не сможет растворить гризеофульвин, который при этих условиях в значительных количествах присутствует в водной фазе. Для перевода всего гризеофульвина в углеводородную фазу желательно добавить в культивируемый продукт углеводородсодержащую среду, которая может быть той же самой или отличаться от уже использованного углеводорода.

Обычно гризеофульвин переходит в углеводородсодержащую фазу, а микроорганизм - в водную. Для выделения используют метод фильтрования и/или центрифугирования.

Все стадии могут быть проведены одновременно и непрерывно.

Состав, содержащий раствор гризеофульвина в углеводороде, пригоден для использования в сельском хозяйстве, в частности в качестве соматического антибиотика, в концентрации 0,1-0,4 г,1л, преимущественно 0,25 г/л. Его можно использовать для обработки почвы, растений, деревьев или семян при борьбе с Alternaria, Helminthosporium, Fusarium, Oidium.

Пример 1. В колбу емкостью 1 л, оборудованную системой аэрации, высевают 500 мл смеси субстрата с питательной средой, содержащей (в г):

Кукурузная вытяжка48

Глюкоза50

Фосфорнокислый калий4

Хлористый натрий1

Смесь разбавляют 1000 ч. мягкой воды, содержащей микроэлементы.

Соотношение между углеродом и азотом в смеси 20: 1. В 48 г кукурузной вытяжки содержится 4 г азота.

К этой смеси добавляют 50 мл суспензии спор штамма Р. griseofulvum-ATCC 11885 и выдерживают при 26°С и рН 4,5-5 при аэрации культуры со скоростью 200 об/час.

Через трое суток мицелий отфильтровывают на воронке Бюхнера и промывают равным объемом среды, состав которой указан ниже.

Мицелий высевают в колбу емкостью 1 ./г с системой аэрации, содержащей 500 мл смеси субстрата с питательной средой, содержащей (в г):

Азотнокислый натрий2

Газойль200

Фосфорнокислый калий4

Хлористый калий1

Сернокислый магний0,5

Раствор микроэлементов5 мл

Водопроводная вода1000 мл

Сернокислый цинк0,1

Сернокислый марганец0,01

Молибденовокислый калий 0,01 Минеральная вода100 мл

Аэрацию проводят со скоростью 600 об,1час. Вначале добавляют 50 г газойля и затем через 1 сутки 16 г, через 2 суток 16 г, через 3 суток 16 г и через 4 суток 50 г газойля.

С целью регенерации неметаболизированного газойля и -биомассы, культуру фильтруют иа воронке Бюхиера через носледующие четверо суток, получая фильтрат, состоящий из водной фазы и газойля, и остаток, содержащий

мицелий.

Мицелий сразу же дважды обрабатывают гексаном н сущат при 90°С. Из фильтрата выделяют газойль с растворенным гризеофульвином.

Содержание антибиотика в неметаболизированном газойле определяют биологическим способом по Fusarium culmorum. Содержание антибиотика в мицелии онределяют следующим способом.

Мицелий сущат при 50°С, взвешивают и измельчают. К 1 г мицелия добавляют 10 мл бутилацетата и перемешивают 1 час при 50°С. После фильтрования на воронке Бюхнера фильтрат концентрируют в вакууме при 50°С,

остаток обрабатывают гексаном и нерастворимую фракцию растворяют в ацетоне в пропорции 1 мл ацетона на 1 г остатка смеси. Эту смесь снова фильтр)ют на воронке Бюхнера и содержаиие гризеофульвина в ацетонном

растворе из.меряют спектрофотометрически в УФ-свете при 288 ммк. Результаты, полученные для Р. griseofulvum, представлены в табл. 1.

Таблица 1

Установлено, что мице.чий почти свободен от антибиотика.

Пример 2. Повторяют способ обработки,

описанный в примере 1, но вместо 50 г глюкозы в первой стадии обработки культуры в

качестве источника углерода используют 150 г

газойля.

Смесь разбавляют 1000 ч. мягкой воды, содержащей микроэлементы. Результаты представлены в табл. 1.

Пример 3. Повторяют способ, описанный Таблица 2 Тяжелые жирные кислоты получают при гидролизе дрожжей, выращенных на фракции нефти, в 10%-ном спиртовом растворе едкого кали в течение 3 час при температуре кипения. После этого полученую смесь обрабатывают петролейным эфиром до восстановления пены тяжелых кислот с последующим окислением и промыванием водой. Остаток представляет собой фракцию тяжелых жирных кислот. Результаты опыта представлены в табл. 1. iB примерах 2-6, как и в примере 1, в качестве микроорганизма используют Р. griseolulvum. Пример 4. Для получения культуры мицелия повторяют первую стадию способа по примеру 1, но культуру выдерживают на кукурузно-глюкозном субстрате в течение девятн суток при аэрации со скоростью 200 об/час в течение трех суток и при аэрации со скоростью 400 об/час в последующие дни. Затем культуру смешивают с 20%-ным газойлем и выделяют антибиотик, как в примере 1. Результаты опыта представлены в табл. 3. Пример 5. Повторяют способ по примеру 4, но культуру выдерживают в течение семи суток на кукурузно-глюкозном субстрате и газойль перемешивают с культурой в течение 66 час. Полученные результаты приведены в табл.3. Таблица 3 Антибиотик, мг Пример 6. Повторяют способ по примеру 5, но в культуру добавляют газойль и выделяют культуру в три стадии. Сначала перемешивают культуру 1 час в 20%-ном газойле с последуюндей регенерацией газойля, затем 1 час в 20%-ном свежем газойле с последуюп 1,ей регенерацией газойля и, наконец, 2 час в 20%-ном свежем газойле с последующей регенерацией газойля. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 50 В целом ЭТО соответствует перемешиванию 1 л культуры с 600 мл газойля в течение 4 час. Полученные результаты представлены в табл. 3. П р и м е р 7. В ферментер-},1ешалку емкостью 15 л заливают 10 л водиой минеральной среды, содержащей (в вес. %): Фосфат натрия трехосновный3,4 Хлористый калий0,6 Сернистый магний0,3 Сернистый аммоний2,5 Состав разбавляют 1000 ч. мягкой воды, содержащей микроэлементы. В ферментер дополнительно вносят несколько миллионов единиц дрол жевого экстракта, а затем 50 г штамма культуры С. tropicalls в виде водной пены, содержащей 20 вес. % сухого материала и 150 г тяжелого газойля, содержащего 20 вес. % углеводородов парафинового ряда. Температура культуры 30±1°С, рН 4. Условия аэрации и перемешивания поддерживаются такими, что в 1 мин в 1 л среды вводят кислорода. Растворение аммиака контролируют автоматическим рП-метром. Когда нлотг1ость ячеек пены достигает 4 г/л, скорость аэрации ферментера составляет 0,1 . К этому времени содержание газойля в ферментере повышается до 120 г/л. Обработанную среду удаляют из ферментера, добавляют (в г/л): 2 азотнокислого калия, 4фосфорнокислого калня, 1 хлористого каЛИЯ и 150 газойля и к 1 л смеси примешивают инокулят, состоящий из Р. griseofnlvum, выращенного на кукурузно-глюкозном экстракте, кяк указано в примере 1. Эту смесь перемещнвают с аэрацией четверо суток. За это время происходит регенерация газойля. Он содержит 2 г/л антибнотнка. Для получения дрожжевого экстракта к верхней фазе, полученной после удаления 65%-ной отработанной среды и замены ее водонроводной водой, добавляют 0,5 г/л неионного моющего средства «НП-29 и в результате конденсации получают продукт, который содержит 1 г-л;оль лаурннового снирта и 8,75 г-моль окиси этилена. После центрифугнрования регенерируют (в г/л): Отработанная минеральная вода839 Неметаболнзированный газойль112 Пастообразная масса мнкрооргаиизма49п Пастоооразную массу микроорганизма про:у1ывают водой при комнатной температуре и центрифугируют. Полученная пастообразная :,асса дрожжей содержпт 65-70% воды. ДТЯ получения иастообразной массы дрожже;, содержащей 50 вес. % сухих дрожжей и 50 вес. % воды, из нее удаляют избыток воды. После этого сырые дрожжи вносят под давлением в экстрактор, представляющий собой горизонтальной оси. В сырые дрожжи добавляют смесь {при соотношении между смесью и сухими дрожжами 8:1), состоящую из 507о гексана и 50% изопропанола. Дрожжи с водой и растворитель выдерживают 30 мин ири 50°С, затем удаляют растворитель, содержащий основную часть загрязняющих веществ. Оставщуюся часть сырых снова обрабатывают смесью растворителей при 50°С в течение 30 лшн, используя 1 ч. воды, 4 ч. смеси, состоящей из 50% гексана и 50% изопропанола, на 1 ч. сухих дрожжей. После удаления экстракта, содержащего загрязнения, остаток обрабатывают 2 ч. смеси, содерл ащей 80% н-гексана и 20% изопропанола. Смесь выдерживают 10 лшн при 50°С, удаляют из нее под давлением растворитель, повторяя процесс очистки четыре раза. Дрожжевой продукт высушивают перегретым паром. Результаты анализа дрожжей до и после регенерации смесью растворителей представлепы в табл. 4. т а б л 11 ц а 4 Полученный дрожжевой продукт, свободный от загрязнений, может быть использован в качестве кормового материала. Характеристика используемогов опытах газойля: Уд. вес. при ,8698 ,4835 Температура помутнения, С+16 Температура застывания, °С-|-15 Содержание серы, %1,67 Содержание н-парафина, %14,7 Предмет изобретения 1. Способ получения антибиотического комплекса, содержащего гризеофульвин, включающий культивирование микробиологического щтамма-продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в том, числе содержащей углеводород, в аэробных условиях и последующее выделение антибиотического комплекса из культуральной среды, отличающийся тем, что, с целью получения комплекса, непосредственно пригодного для использования против фитопатогенных микроорганизмов, культивирование продуцента осуществляют в две стадии с использоваиием в качестве продуцента в первой стадии дрожжей рода Candida, в частности С. tropicalis и С. lipolytica, и во второй стадии - плесневых грибов рода Penicillium, в частности Р. griseofuIvum-ATCC 11885 и Р. nigricans-ATCC 9439, а выделение антибиотического комплекса проводят в виде углеводородной фракции, содержащей антибиотик, с добавлением при необходимости в культуральную среду дополнительного количества углеводорода. 2. Снособ по п. 1, отличающийся тем, что соотношение между углеродом и азотом в нитательной среде составляет в первой стадии кзльтивирования не менее 20 : 1, а во второй стадии культивирования не менее 80: 1.