ШТАММ STREPTOMYCES CINNAMONENSIS AC-1638-ПРОДУЦЕНТ МОНЕНЗИНА А Российский патент 2004 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/465 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к биотехнологическому производству ветеринарного антибиотика - кокцидиостатика монензина.

Впервые кокцидиостатические и антибиотические свойства полиэтерного антибиотика монензина (товарное название “румензин”) были описаны в 1967 году при изучении комплекса A3 823, синтезируемого штаммом Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 [1, 2]. В дальнейшем оказалось, что антибиотический комплекс представлен группой родственных химических структур А, В, С и Д, отличающихся только наличием радикалов в молекуле антибиотика [3]. В комплексе монензинов штаммов промышленных продуцентов преобладают монензины А и В - более 99%. Монензин В обладает примерно в два раза меньшей антибиотической активностью, чем монензин А. Поэтому в ветеринарной практике нашел применение препарат, содержащий не менее 85% монензина А от суммы монензинов.

Конечным продуктом производства является натриевая соль монензина А, нашедшая наибольшее применение при изготовлении различных форм ветеринарных препаратов. Монензин А используется в виде кристаллического порошка или сухой мицелиальной культуры S.cinnamonensis с высоким содержанием монензина в зависимости от форм изготовляемого препарата (инъекционных форм, премиксов и т.д.).

Монензины представляют собой по механизму действия полиэфирные ионофоры, способные изменять проницаемость мембран специфично для ионов натрия. Монензин используют с лечебно-профилактической целью, как противоэмериозное вещество (в виде премикса, содержащего 10% или 20% монензина натрия) у всех видов животных и птиц, кроме лошадей. С профилактической целью применяют на протяжении всего периода выращивания птицы и других животных. Важнейшее свойство - это способность предотвращать развитие кокцидиозов у домашней птицы.

Известны штаммы продуценты монензина, используемые (или использовавшиеся) для промышленного производства в США, Болгарии и Чехословакии [2, 4, 5]. Известен штамм-продуцент монензина S.cinnamonensis ВНИИБТ-5, на который получен патент в России [6]. Однако промышленное производство монензина в России отсутствует.

Цель изобретения - штамм S.cinnamonensis для промышленного производства монензина.

Представляемый штамм S.cinnamonensis AC-1638 (НИЦБ 109) получен из исходного штамма S.cinnamonensis 1009, зарегистрированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ-S1009. Уровень активности исходного штамма в стандартных условиях ферментации в колбах составляет около 12 г/л комплекса монензина, процентное содержание монензина А от комплекса составляет около 70%, что не удовлетворяет современное промышленное производство монензина, а также не соответствует требованиям к качеству получаемых препаратов (содержание А компонента не менее 85%). Описаны способы селекции штаммов продуцентов различных поликетидных антибиотиков, основанные на получении плейотропных мутантов, устойчивых к антибиотикам, в том числе и к хлорамфениколу [7-9]. У одного из продуцентов макролидов установлено, что это обусловлено регуляторной мутацией, активирующей некоторые протеинкиназы продуцента [9].

Способ отбора высокоактивных штаммов S.cinnamonensis продуцентов монензина состоит в том, что споровую культуру штамма, обработанную N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидином (НГ), высевают на стандартную агаризованную среду ISP, содержащую 50 хлорамфеникола и отбирают спонтанные устойчивые к антибиотику мутанты (Cml^r), у которых модифицирована регуляция биосинтеза монензина. Отобранные Cml^r мутанты с повышенной продукцией монензинов (А и В) проверяют на стабильность сохранения полученных свойств. В результате получен штамм S.cinnamonensis НИЦБ 109, обладающий повышенной способностью продуцировать монензин, содержащий монензин А в комплексе не менее 85% и устойчивый к 50 мкг/мл антибиотика хлорамфеникола. Продуктивность монензинов у штамма S.cinnamonensis НИЦБ 109 при определенном режиме регулируемой ферментации в течение 300 часов составляет более 35 г/л. Штамм S.cinnamonensis НИЦБ 109 депонирован в коллекции культур промышленных микроорганизмов ВКПМ (г.Москва) под №АС-1638.

По основным морфологическим и биохимическим признакам S.cinnamonensis AC-1638 (НИЦБ 109) существенно не отличается от типичных продуцентов этого вида и имеет следующие характеристики.

Культурально - морфологические признаки

Спороносцы не спиральные, часто собраны в пучки, сидящие на коротких ножках. Споры овальные, с гладкой оболочкой. Споры образуются на воздушном мицелии. Фрагментации не наблюдается.

На твердой питательной среде (ISP) на 6-е сутки роста при температуре 28°С штамм образует белые округлые радиально-складчатые, морщинистые колонии с сероватым налетом, фестончатым краем и выпуклым темным центром. Диаметр колоний до 2-5 мм. На 9-е сутки инкубации размеры колоний достигают 5-9 мм в диаметре, конфигурация и складчатость колоний не изменяется, окраска становится более интенсивной, образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета. В среду выделяется коричневый пигмент.

На твердой питательной мальтозно-дрожжевой среде (YEME) на 6-е сутки роста при температуре 28°С штамм образует серо-белые округлые радиально-складчатые колонии с фестончатым краем и выпуклым более темным центром. Диаметр колоний до 2-5 мм. На 9-е сутки инкубации размеры колоний достигают 4-8 мм в диаметре, конфигурация и складчатость колоний не изменяется, окраска становится более интенсивной, образуется воздушный мицелий со спорами серо-белого цвета.

Физиолого-биохимические признаки

Сбраживает глюкозу, сахарозу, галактозу, маннозу, мальтозу, фруктозу, рамнозу, маннит, глицерин, ацетат, но не сбраживает лактозу. Желатину разжижает слабо, только пептонизирует, крахмал гидролизует быстро, нитраты не восстанавливает; тирозиназа положительная.

Генетические маркеры.

Устойчивость к антибиотикам: хлорамфеникол - 50 мкг/мл, эритромицин - 100 мкг/мл, тетрациклин - 20 мкг/мл.

Пример 1. Получение штамма Streptomyces cinnamonensis AC-1638 (НИЦБ 109).

Для получения мутантов, устойчивых к хлорамфениколу (Cml^r), исходный штамм подвергали обработке N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидином (НГ). Суспензию спор готовят смывом с “косяка” двухнедельного возраста жидкой средой, используемой для выращивания посевного материала. Полученную суспензию (3 мл) переносят в стерильную пробирку, куда добавляют заранее приготовленный в буфере (рН 8,8-9) раствор НГ в конечной концентрации 30 мкг/мл. Культивирование осуществляют на качалке при 220 об/мин при 28°С в течение 20-25 часов до появления проростков (контроль осуществляется микроскопически). Обработанную таким образом суспензию спор высевают на агаризованную среду ISP, содержащую хлорамфеникол в концентрации 50 мкг/мл. Чашки выращивают в термостате при 28°С в течение 10-14 суток. Образовавшиеся в чашках мутантные колонии (Сml^r) переносят на “косяки” с агаризованной средой ISP и выращивают 14 суток. Выделенные Сml^r мутанты в количестве не менее 500 проверяют на способность к биосинтезу монензина в жидкой ферментационной среде в колбах. Ферментацию осуществляют при температуре 34±1°C в качалочных колбах объемом 750 мл при 260 об/мин. Процесс ферментации двухэтапный. Первый этап - выращивание посевного материала в течение 24 часов на среде следующего состава, %: глюкоза (глюкозные сиропы в эквивалентном количестве) - 1,5-2,5%; соевая мука - 1,3-1,7%; натрий хлористый - 0,3%; мел химический - 0,3%.

Второй этап - процесс биосинтеза монензина, который проводят в течение 240±12 часов на среде следующего состава:

глюкоза (глюкозные сиропы в эквивалентном количестве) - 3,0-4,0%;

мука соевая (крупнозернистая) - 3,0-4,0%; масло соевое (или другие растительные или животные жиры в эквивалентном количестве 5-8%;

марганец хлористый 4х-водный - 0,33%; мел химический осажденный - 0,25%; аммоний сернокислый 0,03%; алюминий сернокислый - 0,07%.

Из проверенных таким образом Сml^r мутантов отбирали варианты с активностью выше исходного штамма. Уровень антибиотической активности определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано в [10]. В результате описанной процедуры был отобран штамм S.cinnamonensis НИЦБ 109 (АС-1638), устойчивый к 50 мкг/мл хлорамфеникола и способный продуцировать при определенном способе культивирования в лабораторном ферментере (см. пример 2) более 35 г/л монензина. Определение компонентного состава монензинов методом ВЭЖХ показало, что содержание монензина А составляет не менее 85%.

Таким образом, изолированный штамм S.cinnamonensis AC-1638 (НИЦБ 109) обладает биосинтетической способностью и качеством (компонентным составом) конечного продукта, заметно превышающей таковую у исходного штамма.

Пример 2. Ферментация штамма Streptomyces cinnamonensis AC-1638 в лабораторном ферментере

Ферментацию осуществляют в две стадии. На первой стадии в колбах объемом 750 мл получают, как описано в примере 1, вегетативный посевной материал. Готовый посевной материал должен соответствовать следующим требованиям:

- по внешнему виду представляет собой густую массу, заполняющую весь объем жидкости;

- цвет - серый или светло-коричневатый;

- при микроскопировании окрашенных метиленовой синью фиксированных мазков в поле зрения должна наблюдаться плотная сетка тонких длинных базофильных гиф;

- рН 6,6-7,0.

Засев ферментера производится вегетативным посевным материалом из расчета 5% от объема ферментационной среды в ферментере. Состав ферментационной среды описан в примере 1.

Через 20 минут после засева из ферментера и в дальнейшем через каждые 24 часа или при необходимости отбирают пробу культуральной жидкости, в которой контролируют: морфологическое состояние культуры; отсутствие посторонней микрофлоры; изменение рН; содержание глюкозы; влажную биомассу; начиная с 72 часов; накопление монензинов; начиная со 120 часов, содержание жира; содержание сухих веществ. Процесс биосинтеза ведут при следующих параметрах:

Температура - 34±0,5°С

Аэрация:

от 0 до 7 часов - 0,20 м³/м³/мин

от 7 до 12 часов - 0,40 м³/м³/мин

от 12 до 16 часов - 0,85 м³/м³/мин

от 16 часов до конца ферментации - 0,90 м³/м³/мин

Давление - 0,3 кг/см²

Перемешивание - непрерывное.

В ходе ферментации рН имеет тенденцию к небольшому повышению с последующим снижением. РН корректируют 25%-ой аммиачной водой. Первые 24-36 часов развития культуры характеризуются сильным пенообразованием. В качестве пеногасителя подают пропинол. После 72 часов роста 3 раза в сутки (через 8 часов) стерильно подается соответствующее количество соевого масла. Количество подаваемого масла зависит от результатов анализа жира, содержащегося в культуральной жидкости. Содержание масла в культуральной жидкости должно быть в пределах 0,3-0,8%. В период от 40 до 100 часов не допустимо снижение липидов ниже 0,3-0,35%.

Со 100 часов начинают подавать стерильную воду порциями автоматически или однократно один раз в 24 часа из расчета компенсации испарения влаги в ходе процесса и недопущения увеличения влажной биомассы в культуральной жидкости более 50%. Начало синтеза антибиотика наблюдается после 36 часов ферментации. Содержание монензина определяют ежедневно после 48 часов ферментации.

При нормальном течении ферментации уровень синтеза монензинов составляет 35-40 г/л, содержание монензина А составляет при этом 85%.

Таким образом, штамм Streptomyces cinnamonensis AC-1638 (НИЦБ 109) обладает высокой способностью к продукции монензина вописанном процессе биосинтеза более 35 г/л высоким содержанием (85%) монензина А.

С учетом вышеизложенного этот штамм может быть использован для промышленного производства монензина.

Список литературы

1. W.M.Stark, N.Knox. Antimicrobial agents and Chemotherapy, 196-8, p.353.

2. Patent US № 3501568, 1970.

3. A.W.Birck, G.A.Robinson. Biotechnology 1995, 28, p.443.

4. Patent US № RE 34698, 1994.

5. Патент ЧССР №272657, 1991.

6. Патент РФ №2057810, 1996.

7. Патент РФ №2142509, 1999.

8. Настасяк И.Н., Заворотная С.А., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и характеристика мутантов Sacharopolyspora erythraea, устойчивых к хлорамфениколу. Антибиотики и химиотерапия, 1999, т.4, №3, стр.5.

9. Елизаров С.М., Миронов В.А., Даниленко В.Н. Изменение активности серин/треониновых протеинкиназ в процессе роста Cml^r мутанта и исходного штамма S.avermitilis. Микробиология, 2000 г, т.69, №3, стр 345.

10. ТУ 9291-001-18811167-00. Биомасса сухая штамма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109.

Изобретение относится к микробиологической промышленности (биотехнологии). Штамм Streptomyces cinnamonensis AC-1638 продуцент ветеринарного антибиотика кокцидиостатика монензина получен из штамма S.cinnamonensis S1009 путем обработки нитрозогуанидином и селекции на агаризованной среде, содержащей антибиотик хлорамфеникол, с последующей изоляцией мутантов, устойчивых к 50 мкг/мл хлорамфеникола, отбором среди них вариантов с наиболее высокой продукцией антибиотика монензинов. Штамм ВКПМ АС-1638 обладает продуктивностью более 35 г/л при регулируемом процессе ферментации с содержанием монензина А от комплекса монензинов не менее 85%, что позволяет использовать новый штамм для рентабельного промышленного производства монензинов.

Штамм Streptomyces cinnamonensis ВКПМ-1638 - продуцент монензина А.