мальном объеме 0,01-0,1 М СНзСООН и вгоричио лр01пу|С каю1т через колонку. noiBiTOpiHo OTooipaiHiHbie: фраищии сушат лиофильью или на раслылителыной .
В предлагаемом способе используют нейтральные молекуляриые сита, не подвергающиеся воздействию ферментов и не адсорбирующие их. Размер пор геля выбирают так, чтобы они Ее пр(апу1акали вещества с молакулярны1М весом более 10000-17000.
При элю1ИрО1ваН1ии раствора ферментного п-репарата через колонку с таким молекулярНЫ1М оитоМ все электролиты (иключая уксусную кислоту, в которой растворялись препараты и ацетат кальция), а также неадсорбирювайные белками л фер-ментами примеси, И1меющие молекулярный вес меньше 10000- 17000, постепенно проникают в поры гранул геля, и окорость их движения замедляслгся.
Оитменты и др|угие привдеси, образующие ко1М1Пле1К1СЫ с ферментами и имеющие общий молекулярный вес (в комплексе белок - примесь) значительно больше 10000-17000, движутся по коло1Н|ке между гранулами геля (в пустом объеме геля) с большей скоростью, че1м ниэковдолакулярные вещества. Благодаря разности в скорости движения на первом этапе элюирования происходит отделение белков и о,бразующих с ними комплексы првмесей от веществ, не образующих с ними комплексов, имеющих молекулярный вес меньше 10000- 17000, включая уксусную кислоту, в которой раст ворялись ферментные препараты и ацетат кальция. Комрлексы фермент-пи-гмент «ли фе1рмент-при1месь, отделившиеся на первом этаие элюирования от вышеуказанных веществ попадают в 0,001-0,009 М СНзСООН. В результате связи между фер;ментами и п игментаМИ разрешаются. Белии и ферменты, имеющие молекулярный вес больше 10000- 17000, движ/зтся с большей скоростью в пустюм объеме геля, а пигменты и другие примеси, имеющие молекулярный вес меньше 1.0000-17000, попадая в внутренний объем геля, замедляют свое движение и отделяются 01Т ферментов. Поэтому бел1К1И и ферменты выходят из колонки абессоленньгми в 0,001- 0,009М СНзСООН и раньше, чем остальные примесн.
Предлагаемый способ является способом очистки всего ко1М1Пле1Кса ферментов от П1игMeHTOiB, элект|ролито1в и небелковых примесей. Имеющих молекулярный вес до 10000-17000.
Разработанный сяо|со.б очистки ферментов Исключает диализ ферментов, которые в процессе очиспки об;ессол1И1ваются и выходят из колоНКи с уксусной кислотой неэначительной концентрации (0,001-0,009М), что позволяет полученные ферменты сразу же высущ И1вать.
Глубокая очистпка ферментов от пигментов и других небелковых примесей значительно облегчает фракционирование ферментов и на ионоо бменн1иках.
Пример 1. Для ОЧИСТ1КИ используют ферментный препарат, выделенный из глубинной
культуры Asp. niger путем осаждения этилоВЫМ спиртом. Получают 5%нный раствор препарата (рН 4,5) в 0,1М СНзСООН, осадок отбрасывают, а полученный образец наносят
на слой биогеля П-10, уравновешенный 0,007 М СНзСООН.
Па фиг. 1 приведена хроматограмма, где /-поглощение света лри 280 ммк, 2 - поглощение света при- 454 ммк (кривая распределения пигментов) и 3 - лротеолитическая акТИ1ВНО|СТЬ.
Вертикальный пунктир показывает границу пустого объема геля, находящегося влево от него.
Из графика: видно, что вся активность ферментов сконцентрирована в первом пике и практически полностью отделяется от пигментов и других примесей, которые отстают и выходят из колонки вторым пиком.
ПрИМер 2. Осуществляют очистку ферментных препаратов, выделенных из поверхноютных культур Asp. oryzae и Asp. awamori. Для приготовления 10%-иых растворов препаратов (рН 4,8-5,0) используют 0,1М.
СНзСООН.
Предварительную очистку от балластных веществ проводят согласно оп} санию.
Дальнейшую очистку ферментов проводят на колоннах с биогелем П-10, уравнавешенны,м 0,001 М СНзСООН.
XpOiMarorpa MiMbi опытов показаны на фиг. 2 (Asp. oryzae) и фиг. 3 (Asip. awamori), на которых номера кривых и их названия соответствуют обозначениям на фиг. 1.
Из графиков ВИДН10, что прарктически вся акт ивность фер1ментов концентрируется в выаакомолекулярной фракции препарата, находящейся в пределах пустого объема геля (первый пи|к) в то время, как пигменты концентрируются в низкомолекулярной фракции препарата, фракционирование которых происходит во :внутрен1нем объеме геля (второй и третий пики). Таиим о|бразО|М, в этих опытах происходит полное отделение ферментов от
пигментов и других при.месей, молекулярный вес которых не превышает 10000-17000.
Пр.имер 3. Для очистки используют ферментный препарат № 49, полученный из поверх1нос11ной культуры Asp. terricola. 10%-ные
растворы препарата (рН 5,1) получают с помощью 0,1М СНзСООН. Предварительную очистцсу от балластных вещесив проводят с использованием равных объемов 20%-iHoro растаора ацетата кальция. Дальнейшую очисгку
от пигментов и других при.месей проводят (согласно методике, изложенной в описании) на биогеле П-10, уравновешенном 0,007 М СНзСООН. Хроматаграм1ма опыта показана на фиг. 4,
где номера кривых и их названий соответствуют обо-31начен1ИЯ|М на фиг. 1. Из графика видно, чтпо вся прОтеОлитическая активность сосредоточена в фракциях, соответствующих пустому объему геля. Отбирают по объему
70% фракций (на фиг. 4 указано стрелкой), в
которых находится 80-90% а|Кти1вност|и ферментов. Оставшуюся часть фракций отбрасываю1т, не умеиьшая удельную а ктивиость ферментов (на 1 г сухого вещества). На графике
видно, что пигменты отделяются от высокомолекулярной фракции И выходят в составе следующих пиков. Результаты очистки приведены в таблице.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ получения лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы | 1976 |
|
SU578335A1 |
| ФЕРМЕНТ КАРБОКСИПЕПТИДАЗА КПSВ, ШТАММ Streptomyces bikiniensis - ПРОДУЦЕНТ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ КПSВ, ФРАГМЕНТ ДНК SB27-995, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ ЗРЕЛОЙ ФОРМЫ ЭТОГО ФЕРМЕНТА, И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ КПSВ | 2008 |
|
RU2388825C1 |
| Способ получения производных аминосахаров | 1974 |
|
SU562202A3 |
| ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ГИАЛУРОНИДАЗА ИЗ Streptomyces koganeiensis | 2010 |
|
RU2553205C2 |
| ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ L-ЛИЗИН-α-ОКСИДАЗЫ ИЗ ГРИБА РОДА TRICHODERMA И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТОГО ФЕРМЕНТА | 2002 |
|
RU2233171C2 |
| ФЕРМЕНТ ПРОТЕАЗА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ | 2012 |
|
RU2611043C2 |
| Способ получения биоплазмозаменителя гемодинамического действия | 2020 |
|
RU2749266C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИДИРОВАННОГО ПЕПТИДА | 1988 |
|
RU2252961C2 |
| НОВЫЙ ФЕРМЕНТ, ОБРАЗУЮЩИЙ ПЕПТИД, МИКРООРГАНИЗМ, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ДАННЫЙ ФЕРМЕНТ, И СПОСОБ СИНТЕЗА ДИПЕПТИДА С ИХ ПРИМЕНЕНИЕМ | 2003 |
|
RU2300565C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРОЛЭСТЕРАЗЫ, ТРИПСИНА, ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗЫ И РИБОНУКЛЕАЗЫ ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 2005 |
|
RU2311455C2 |
Как видно из таблицы, активность протеиназ в 30-34 раза, выход ферментов, в среднем, составил 60%, а количество пигментов уменьшилось более, чем в 100 раз.
Для сравнения привадим опыт по очистке этого же исходного препарата на биогеле П-10, слой iKOTO,poiro ура1В навешен не уксусной кислотой, а дистиллированной в 0|дой (ф1иг. 5). Препарат перед очисткой растворяли в 0,1 М ацетат - НС1 буфере с добавлением 1 % NaCl для создания большей йодной силы (рН 5,1). Элюирование образца проводили дистиллированной водой. Хроматограмма состоит пра.ктичеоки из одного большого пика. КОНцентрация белковых веществ на ней совпадзет с концентрацией пигментов (кривые / и 2). Поэтому в фра кции, составляю:шие пустой Объем геля, где находилась вся активность ферментов, переходит свыше 40% всего количества пигментов.
Предмет изобретения
. Опосо-б очистки ферментов от пигментов путем растворения фермента и нанесения полученного раствора на колонку с м олекуляцным ситом с носледуюгцим элюирова гчелт
ферментов, отличающийся тем, что, с целью более полной очистки ферментав. перед нанесением фер|ментного раствора колон К уравновешивают К0|милексоо.бразлющим веществом.
протеолитических ферлтентав рН раствора устанавливают равным 4,5-5,1.
70
30
