Способ получения лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение относится к области технической микробиологии и может быть иснользовано для получения ферментных препаратов, в частности пептидаз из микробиологического сырья.

Известен способ пол}чения лейцил-глицилглицин-аминопептидазы, предусматриваюндий осаждение белков из ферментного сырья, полученного из грибов рода Aspergillus, обессоливание белковой фракции, фракционирование белков кол-оночной хроматографией на сефадексе, диализ пептидазной фракции с выделением целевого продукта и его лиофилизацию в фосфатном буфере.

Однако используемые в известном способе в качестве ферментного сырья штаммы Aspergillus oryzae и aspergillus paraziticus продуцируют токсины, от которых не удается освободиться на последующих этапах очистки.

Цель изобретения - получение фермента, свободного от токсичных примесей, и повышение его стабильности.

Для этого осаждение белков из ферментного сырья, полученного из грибов рода Aspeigillus, проводят в присутствии ионов кобальта, перед диализом осуществляют инактивацию протеиназы, а лиофилизацию проводят при рН 7,8-8,0. При этом протеиназу инактивируют нагревом в течение 10-15 мин до 62°С с последующим охлаждением до 20°С.

Сущность предлагаемого способа заключается в обработке ферментного сырья из щтамма Aspergilius, осаждении белков сульфатом аммония, обессоливании белкового осадка, фракционировании белков колоночной хроматографией на сефадексе, диализе пептидазной фракции с выделением целевого продукта и его лиофилизации в фосфатном буфере. Концентрированный препарат поверхностной

культуры Aspergillus flavus растворяют в воде с добавлением 0,001-0,0001 М раствора хлористого кобальта, осаждают низкомолекулярные белковые примеси этанолом. В полученной после дробного осаждения и центрифугирования ферментной фракции инактивирзют протеиназу нагревом в течение 10- 15 мин, обеспечивая перепад температур от 62 до 20°С, а очищенную лейцил-глицил-глицин-аминопеитидазу лиофилизуют из кобальтсодержащего раствора при рН 7,8-8,0.

При.мер. 100 г концентрированного препарата поверхностной культуры Aspergillus flavus - флавизина, полученного Украинским научно-исследовательским институтом

пищевой пpOJMЫщлeннocти, обрабатывают семикратным объемом воды, содерйсащей ионы Со+2, в течение 2 час для извлечения низкомолекулярных веществ и других примесей. Смесь центрифугируют в течение 40 мин при

3000 об/мин. Полученный раствор, содержащий пигменты, примеси углеводородов, протеазы и пептидазы, охлаждают до 2°С и прибавляют этиловый спирт до конечной концентрации 50% при температуре - 8°С. Выдерживают систему в течение 20 мин, а затем центрифугируют на холоде.

Полученный белковый осадок, содержащий протеазы и нептидаэы с примесью углеводов и пигмента, растворяют в двойном количестве по отношению к исходной навеске флавизина дистиллированной воды, содержащей ионы . Нерастворившуюся часть удаляют центрифугированием.

К надосадочной жидкости, содержащей протеазы и пептидазы, прибавляют сухой сульфат аммония до 40% от полного насыщения и выдерживают в течение 15-18 час при комнатной температуре. Белок, вынавщий в осадок, отделяют центрифугированием, а в полученном растворе проводят повторное насыщение сульфатом аммония до 80% от полного насыщения. Через 6-8 час смесь центрифугируют, а осадок, содержащий протеины и нептидазы, растворяют в половинном объеме дистиллированной воды, содержащей ионы Со+2. От сульфата аммония освобождаются диализом против 0,0067 М фосфатного буфера при рН 7,8-8,0.

Для инактивации нротешшзы полученный диализат подогревают до 62°С в течение 10 мин и сразу же охлаждают на водяной бане до 20°С. Денатурированный белок, содержащий пептидазы, удаляют центрифугированием, а пептидазную фракцию очищают на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой при линейном градиенте 0,1-0,7 М NaCl в 0,02 М фосфатном буфере при рН 7,8-8,0.

Активную фракцию, полученную после обессоливаиия диализом, хроматографируют на сефадексе Г-100 в фосфатном буфере и лиофилизуют из кобальтсодержащего раствора при рН 7,8-8,0.

Расчет активности ЛГГ-аминопептидазы проводят по формуле:

Активность лейцил-глицил-глицин-аминоцептидазы

а-1000.103.100

;: Д-

b-c-t-x%

где а - количество очищенной аминокислоты (в перерасчете но оптической плотности), 7;

1000 - перевод j в мг; Ю -перерасчет до целого числа; b - молекулярный вес расщепленного пептида;

с - навеска фермента, 7; t - время инкубации, мин;

100,,,

- -перерасчет на 1 мг чистого белка;

Х96

х% содержание чистого белка в препарате.

Способ позволяет получить высокоочищенный препарат лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы, гомогенный при электрофорезе в

полиакриламидном геле, а также при исследовании его методом экзимэлектрофореза.

Предлагаемый способ позволяет получить препарат ЛГГ-аминопептидазы с активностью, составляющей 24% по сравнению с

активностью концентрированной поверхностной культуры Aspergillus flavus, со степенью очистки в 237 раз и свободный от токсических примесей. Полученный лиофилизированный ферментиый препарат полностью сохраняет исходную активность в течение года при хранении его при 4°С.

Формула изобретения

1.Способ получения лейцил-глицил-глицин-а.минопептидазы, предусматривающий осаждение белков из ферментного сырья, полученного из грибов рода Aspergillus, обессолнвание белковой фракции, фракционирование белков колоночной хроматографией на сефадексе, диализ пептидазной фракции с выделением целевого продукта и его лиофилизацию в фосфатном буфере, отличающийся тем, что, с целью получения фермента, свободного от токсичных примесей, и повышения стабильности фермента, осаждение белков из ферментного сырья, полученного из грибов рода Aspergillus, проводят в присутствии ионов кобальта, перед диализом осуществляют инактивацию протеиназы, а лиофилизацию проводят при рН 7,8-8,0.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что протеиназу инактивируют нагревом в течение 10-15 мин до 62°С с последующим охлаждением до 20°С.