Способ получения производных аминосахаров Советский патент 1977 года по МПК C07H5/06 

Для проведения предлагаемого споеоба применяют твердые и жидкие, в частности жидкие, водные питательные среды, которые наряду с источниками углерода содержат источники азота, соли и антивспениватели в обычных концентрациях. Концентрации могут колебаться в широких пределах.

В качестве источников углерода служат преимущественно углеводы, в частности крахмал, мальтоза, глюкоза и смеси из двух (или трех) из этих веществ, а также комплексные смеси, например солодовый экстракт.

В качестве источников азота можно использовать обычно принятые в микробиологии комплексные смеси, например гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, пептон, рыбную муку, растворимые рыбные экстракты, воду от набухщей кукурузы, мясной экстракт и также смеси, кроме того, аминокислоты и/или аммониевые соли.

При проведении предлагаемого способа обычно работают в аэробных условиях в проветриваемых культурах, выращенных при постоянном встряхивании, или в культурах, выращенных в сосудах. РОД и концентрация углеродного источника в комбинации с применяемым для ферментации штаммом настолько влияют на род целевого продукта в отношении доли радикала R, что отдельные звенья гомологического ряда или по меньщей мере очень узкую область гомологов можно получать почти селективно. Оказалось, что в питательных средах, содержащих более 2% крахмала, образуются прежде всего производные аминосахароБ с 4-7 единицами гексозы и что для этой цели особенно пригодным штаммом является SE 50/13 (CBS 614.71). Однако при известных условиях для получения смесей производных аминосахаров с 4-7 единицами глюкозы достаточно к питательным средам, содержащим, например 3,5% глюкозы, в качестве источника основного углерода добавить 0,1-3%, предпочтительно 0,5-2% крахмала. Кроме того, оказалось, что в питательных средах, не содержащих крахмала, в частности после добавки мальтозы к питательной среде, Б частности со штаммом SE 50 (CBS 961.70), преимущественно получают производные аминосахаров с 2-3 единицами гексозы. Особенно выгодными для получения предлагаемого производного аминосахаров с R-глюкозой оказались питательные среды, которые как источник углерода содержат только глюкозу. Если питательная среда содержит избыток глюкозы, то при более длительной ферментации образуются также производные аминосахаров с более длинной цепью. Это В определенных пределах можно предупредить, следя за тем, чтобы при ферментации истощение азотных источников совпадало с моментом истощения глюкозы. Если питательные среды не содержат глюкозы и в качестве углеродного источника служит мальтоза, то преимущественно получают производные аминосахаров с 2 единицами гексозы, причем чистую мальтозу можно заменить более дешевыми смесями, например мальтцином, естественным солодовым экстрактом фирмы «Диамальт АГ, Мюнхен, ФРГ. В зависимости от содержания малтотриозы образуется также следующий высщий гомолог. Особенно выгодным для получения низщих гомологов оказался щтамм SE 50/110, который в оптимальных питательных средах дает примерно вдвое больщий выход низших гомологов, чем щтамм SE 50/13.

При ферментациях состав остальной питательной среды, в частности концентрация азотных источников, и состав солей могут колебаться в щироких пределах.

Питательные среды стерилизуются обычными способами. Значения рН питательной среды колеблются в пределах от 5,0 до 8,5, предпочтительно от 6,0 до 7,8. Температуры для выращивания составляют 15-45°С, предпочтительно 24-32°С. Для получения высших гомологов с штаммами SE 50 и SE 50/13 выгоднее работать при более высокой температуре, например при 28°С, для получения низщих гомологов с щтаммами SE 50 и SE 50/110 при более низкой температуре, например при 24°С. Период выращивания составляет 1-8 дней, предпочтительно 2-6 дней. Более длительный период выращивания, в частности при избытке углеводов, благоприятствует образованию высших гомологов. Окончание ферментации определяют ферментативной пробой на наличие замедляющего действия и тонкослойной хроматографией.

Низщие гомологи предлагаемых производных аминосахаров можно также получать из высщих гомологов отщеплением единиц гексозы. Отщепление происходит с помощью водных кислот, в частности 1-5 нормальных минеральных кислот в течение 10-180 мин при температурах от 50 до 100°С, в частности при температурах от 90 до 100°С, или посредством инкубации ферментами (гидролазами), в частности |3-амилазами или неингибируемыми а-амилазами или амилоглюкозидами микробного происхождения, например, а-амилазами из В. subtilis или посредством инкубации микроорганизмами, которые растут в питательных средах, которые предпочтительно как единственный источник углерода содержат высщие гомологи предлагаемых производных аминосахаров в количестве от 1 до 10%, предпочтительно от 2 до 5%, как, например, Aspengillus niger (АТСС 11.394).

Выделение и очистку предлагаемых производных аминосахаров осуществляют из микробиологических культурных бульонов или кислых гидролизатов, или инкубационных смесей, в которых проводилось ферментативное и/или микробиологическое разложение высщих гомологов производных аминосахаров.

В зависимости от пределов молекулярного веса, к которым относятся выделяемые вещества, необходимы различпые методы разделения. Высшие гомологи выделяют непосредственным осаждением после предыдущих обесцвечивания и концентрации растворов.

Низкомолекулярные гомологи получают предпочтительно адсорбцией на активном угле при нейтральном значении рН, при последующей десорбции водными спиртами или ацетоном, предпочтительно 50-80%-ным ацетоном. Десорбция удается полностью при кислых значениях рН в пределах от рН 1,5 до 4, предпочтительно от рН 2 до 3.

Если исходные растворы имеют очень темный цвет, их обесцвечивают до адсорбции предлагаемых веществ посредством активного угля при кислых значениях рН (рН 1-3) или неспецифическими адсорбционными смолами, например, Lewapol Са 9221 (размер зерен 0,35 мм) фирмы «Байер АГ, в пределах рН от 2 до 7, предпочтительно от 2 до 3. Активный уголь только в кислой области предпочтительно связывает красители, в то время как Lewapol ни в нейтральной, ни в кислой областях не адсорбирует предлагаемые производные аминосахаров, имеющие ингибиторное действие.

Для отделения ингибиторных производных аминосахаров от неактивных сахаридов и других неактивных соединений используют слабощелочной характер этих компонентов. При подходящих условиях (рН 1-8, предпочтительно рН 2-4; при слабой ионной силе, соответствующей электропроводности 10 мл сим, предпочтительно 2 мл сим) гомологические производные аминосахаров в Н+-форме связываются сильнокислыми катионитами, например, Dowex 50 V (фирмы Dow Cneniicals). Как было установлено заявителем, имеющие замедляющее действие производные амипосахаров особенно хорощо связываются с катнонитами из ацетонового раствора (50- 80%-ный ацетон, рН 1-5, предпочтительно рН 2-4), которые при этих условиях обнаруживают гораздо большую емкость для веществ. При условии, что раствор содержит более 50% ацетона, удается также довольно хорошая связь с слабокислыми понитами, например, Amberlite ШС-50 (Н+-форма).

Для десорбции предлагаемых производных аминосахаров из катионитов применяют водные основания или кислоты, предпочтительно аммиак или соляную кислоту в концентрациях 0,01 - 1 валин/л. Из элюатов получают ингибиторно-активные производные аминосахаров - после нейтрализации элюатов соответствующим слабокислым или основным ионитом или после удаления основания или кислоты вакуумной перегонкой в случае летучих оснований ики кислот - после концентрации раствора лиофилизацией или осаждением органическими растворителями, предпочтительно 10-20 объемными частями ацетона.

Кроме того, низкомолекулярные ингибитррно-активные производные аминосахаровотделяются от инертных сахаридов хроматографией ионитами на основе целлюлозы, предпочтительно фосфоцеллюлозы (фирма «Серна, ГеПдельберг). В качестве растворителей применяют буферы, пердпсчт ;тельпо фосфатные бзферы с слабо nciiiioii силой, предпочтительно 2-100 мМ, в частости 5-10 мМ, в пределах рП от 2,5 до 8, прсдпочтптельпо при рН 5-6. Предпосылкой для эффективного фракционирования является как можно малое содержа 1ие солей в препаратах, подвергаемых

фракционированию, в то время как красптели почти пе мешают.

Для получения отдельных звеньев предполагаемого гомологического ряда ингибиторпоактнвных пропзводных амнпосахаров в чистом

впде предварительно очищенные препараты хроматографпруют па пригодном молекулярном сите, например Bio-GeP Р-2 (фирмы «Био-Рад, Мюнхен), и тонкослойпой хроматографией исследуют фракцпп элюата. Фракции,

содержащие чпстые пропзводпые аминосахаров, соедппяют, повторно хроматографируют и после копцентрацпп лнофплпзпруют или, как было описано вьпле, осаждают органнческпм растворителе:,.

В следующих примерах гексозпые единицы представляют собой глюкозные единицы.

Прпмер 1. В некоторых пр 1мерах в качестве ИСХОДНО пренарат, получаемый следу1ощ 1М образом.

В сте1чЛЯ Ь Й формеитср с 8 л питательного раствора, состоя цего 5% крахмала, 1,0% дрожжевого экстракта, 0,2% К2НРО4, из качалочпой колбы подают трехдневный штамм SE 50/13 (CBS 614.71) и прп тщательпом размешнва п п проветр шанп инкубпруют в течение 3 дней прп 28°С, прп этом получают культуральн}чо жидкость с 105000 ед. ннг.

.

6 л этой фер; е1 та ию11ной жидкости после

охлажден я до 20°С подкпсля от нолу :онЦентрированной nNOs (рМ 2,5), добавляют 30 г карбораф Н 1рова 1пого активного зтля, перемешпва от в течение 10 , центр фугируют в течение 15 мни npi 10000 об/м1 Н и прозрачный светло-желтый остаток после нейтралнзацпп NHs сгущают до 500 мл, 500 мл ко щентрата в течение 45 мпп с 200 г амберл 1та IRA410 С1, ф льтруют на и прибавляют 4/5 объемных частп (около

400 мл) метанола, чтобы основное колпчество высокомолекуляр гых проду тоБ расщенленпя крахмала (вместе с еще нал 1чнымн остаткам а т 1виого угля). Цептр фугируют в течен е 5 мин пр 5000 об/м, 850 мл остатка пр Т цатель ом размещ вап по каплям добавля от к 4 л сухого . Белый хлоньевпдпый осадок па 1утче, 3 раза промыва от , 2 раза сушат в вакууме при . Выход 36 г белого порошка с lO-lO ед. г. амнлазы/г.

П р м е р 2. Для о( ,елево -о продукта ферментации п состава препаратов тонкослойной хромато раф|1ей 1 мл ферме тацпоппых Ж дкостей 1лп мг препаратов 1аносят на C iликагельпые плепкп (фирмы Schleicher и

Schiell, Dassel, Тур F 1500) и 2 раза проявляют в системе н-бутанол/этанол/вода 50 : 3 : 20. Для цветного изображения иигибиции сахаразы проявленную и хорошо высушенную пластинку (20 м/20х20 см) опрыскивают ферментативным гелем и дают ему отвердеть.

Затем в течение 5 мин при комнатной температуре нредварительио инкубируют во влажной камере и затем до насыш,ения онрыскивают субстратным гелем. После отвердения второго слоя геля нластинку номешают в влажную камеру и инкубируют ири 40°С. Ингибинионная окраска (светлые пятна, краснокоричневый фон) проявляется через 60- 90 мин. При онтимальном проявлении цвета прерывают процесс и пластинку с находящимися на ней агаровыми слоями сушат горячим воздухом.

Прнготовлеиие гелей.

Ферментативный гель - 1,5 г агарозы (Llndustrie Biologique Francais) суспендируют в 100 мл 0,2 М Na-малеинатного буфера со значением рН 6,0 и затем растворяют при кипячении. Прозрачный агаровый раствор охлаждают до 50°С и при перемешивании добавляют 250 мл тритон Х-100-раствора (2 г тритона Х-100 + 8 г этанола) и 0,5 мл дианизндннового раствора (20 мг дианизидина/1 мл ацетона). Пеиосредственно до употребления геля добавляют 1 мл GOD/POD-реактива (12,5 мг оксидазы глюкозы, степень чистоты, фирмы «Берингер, № заказа 15423 и 2,5 мг пероксидазы , степень чистоты И, фирмы «Еерингер, N° заказа 15302, растворенные в 5 мл малеинатного буфера) и 4-6 единиц сахаразы из тонкого кишечника свиньи. До опрыскивания гель нужно выдерл ивать при температуре 50°С, так как иначе он при процессе опрыскивания затвердевает в соплах.

Субстратный гель: 0,5 г агарозы суспендируют в 100 мл Na-малеинатного буфера с рН 6,,0 и растворяют при кипячении, охлал дают до 50°С, добавляют 100 мл тритона (2 г тритона Х-100-|-8 г этанола) и добавляют 1 г сахаразы (фирмы «Серва N° 35579). После растворения сахаразы гель готов к применению. Для цветного изображения ингибиции амилазь проявленную и высушенную ТХ-пластинку опрыскивают амилазным гелем (20 мл/20Х Х20 см пластинка) и оставляют отвердеть. После пятиминутной нредварительной инкубации; при комнатной температуре пластинку, покрытую слоем геля, погружают в 0,5%-ный крахмальный раствор (I г крахмала фирмы «Мерк 1252 в 200 мл 0,2 М глицерофосфатного буфера, 0,01 СаСЬ, рН 6,9, растворенных нри кнпяченни) и выдерживают в нем в течеиие 2 мин при 40°С, перемешивая раствор. Затем пластинку хорошо промывают дистиллированной водой и для окрашивания нерасщепленного крахмала погружают в разбавленный J2-pacTBOp (4 мл Jj-pacTBOpa на 500 мл ПгО; Л2-раствор: 2,2 г J2 + 4,4 г KJ, растворенных в 100 мл Н2О). Через 1 мин получают оптимальную окраску.

Приготовление амилазного геля

1 г агарозы ри 100°С растворяют в 100 мл 0,2 М натрийглицерофосфата/0,01 М СаСЬ-буфера со значением рН 6,9, после охлаждения 5 до 50°С добавляют 100 мл тритона Х-100 (2 г тритона Х-100 + 8 г этанола). Пеносрел,ственно до опрыскивания добавляют 100 мл суспензии амилазных кристаллов (10 мг амилазы из поджелудочной железы свиньи/мл насыщенно10 го НН4-сульфатного раствора фирмы «Берингер, №. 15017).

Пример 3. В колбу Эрленмейера емкостью 1 л с 120 мл иитательпой жидкости, состоящей из 4% крахмала, 2,4% глюкозы, 0,9% гидро15 лизата казеина и 0,9% дрожжевого экстракта, значение рН которой посредством NaOH установлено на 7,6, к которой добавлено 0,4% СаСОз и которая стерилизована в течение SO мин при 121°С, засевают 3 мл предварительного щтамма SE 82, выращенного в питательной жидкости из 2% крахмала, 1% глюкозы, 0,5% гидролизата казеина и 1% дрожжевого экстракта, значение рП которой посредством NaOH доведено до 7,2, к которой

5 добавлено 0,4% СаСОз и которая стерилизована в течение 30 мин при 121°С, и инкубируют в течение 5 дней при 28°С на качалке. Получают культуральный раствор с 122000 ед. ИНГ. амилазы/мл.

0 Для дальнейшей переработки мицелий центрифугированием при 12000 об/мин отделяют от соединенных культуральных жидкостей, 300 мл культурального фильтрата подкисляют полуконцентрированной азотной кислотой до

5 рН 2,5 и в течение 10 мин неремешивают с 2,5 г активированного угля. После отделения угля при 12000 об/мин к раствору, нейтрализованному до значения рН 6 посредством Юн. КОН, добавляют 300 мл метанола, выдерживают в течение короткого времени и при 12000 об/мин удаляют осадок. Остаток по каплям добавляют к 3 л этанола, осадок после непродолжительной выдержки центрифугируют при 12000 об/мин, два раза нромыва5 ют абсолютным этанолом и один раз эфиром, сушат в вакууме, получают 2,23 г продукта с 7,45-10 ед. ИНГ. амилазы/г, который более чем на 95% содержит гомологи производных аминосахаров с .

Пример 4. В колбу Эрленмейера емкостью 1 л с 120 мл питательной жидкости, состоящей из 3,5% глюкозы, 2% крахмала, 0,5% гидролизата казеина, 1,3% дрожжевого экстракта, 0,3% СаСОз и 0,3%К2ПРО4, значение рН которой до стерилизации устанавливают на 7,8 и которая стерилизована в течение 30 мин при 121°С, засевают 6 мл предварительной культуры штамма SE 50/110, выращенной в питательной жидкости, состоящей из 3% соевой муки, 3% глицерина и 0,2% СаСОз, и инкубируют в течение 3-4 дней при 24°С на качалке. Получают культуральный раствор, содержащий 153000 ед. инг. амила5 зы/мл Й- 12200 ед инг. сахаразы/л.

1 л культурального раствора подкисляют азотной кислотой до pli 2,5, в течение 10 мин перемешивают с 5 г активированного угля и затем в течение 30 мин центрифугируют при 5000 об/мин. Нейтрализуют 25 г амберлита IRA 410 (ОН -форма). Остаток упаривают до 100 мл, добавляют 100 мл метанола и фильтруют. Фильтрат прибавляют к 2 л спирта, выпадающий осадок фильтруют на нутче, три раза промывают ацетоном и эфиром и сушат в вакууме.

Выход 14 г белого порошка с 5-10 ед. инг. амилазы/г, который преимущественно содержит гомологи с .

Пример 5. Работают аналогично примеру 4, однако с добавкой 0,5% крахмала и после четырехдневной ферментации получают культуральный раствор с 40000 ед. инг. амилазы и 184 ед. ИНГ. сахаразы/мл. Культуральный раствор содержит гомологи, начиная с .

Пример 6. В колбу Эрленмейера емкостью 1 л с 120 мл питательной жидкости, состоящей из 3% глюкозы, 0,6% гидролизата казеина, 1,6% дрожжевого экстракта, 0,3% СаСОз, 0,3% КдПРО, значение рП которой до стерилизации посредством КОН доведено до 7,8, засевают предварительной культурой щтамма SE 50/110 по примеру 4 и инкубируют в течение 4 дней при 24°С на качалке. Получают Культуральный раствор с 10 800 ед. инг. сахаразы/л, который преимущественно содержит производное аминосахаров с .

5 л культурального фильтрата при 1300 об/мин отделяют от мицелия, полуконцентрированной азотной кислотой раствор подкисляют до рН 2,5 и в течение 15 мин размещивают с 55 г активированного угля (фирмы «Мерк) и 200 г Clarcela. После удаления твердых веществ отсасыванием раствор нейтрализуют концентрированным аммиаком до рН 7, упаривают до 1,5 л и осаждают пятикратным количеством этанола. Полученный хлопьевидный осадок отделяют центрифугированием при 1200 об/мин, желтоватый остаток упаривают до 150 мл и для отделения незначительных нерастворнмых частиц центрифугируют с небольшим числом оборотов. 50 мл этого раствора наносят на наполненную амберлитом Ш-120.(Н+-форма) колонку (30X300 мм; 30 мл П2О в час). Собирают 300 мл элюата, содержащего инертные сахариды, а также долю неадсорбированных ингибиторно-активных компонентов, ионит примерно с 400 мл воды вливают в химический стакан и при размешивании добавляют концентрированный аммиак до рП 11,5. Перемешивают еще в течение 30 мин и отделяют ионит, остаток концентрируют до 1/20 объема, фильтруют через колонку (20X150 мм), наполненную амберлитом IRA-410 (ПСОз-форма), и при скорости 30 мл/час собирают 500 мл элюата, который концентрируют и затем лиофилизируют, причем получают 1,3 г сырого продукта.

Для дальнейшей очистки сырой продукт фракционируют с Bio-Gel Р-2 100--200 меш

(фирмы «Бно-Рад, Мюнхен). Для этой целп применяют колонку диаметром 50 мл и длиной 450 мм, которая работает на воде при скорости 40 мл/час, причем собирают фра ;ции по 10 мл. Все фракции посредством антроновой пробы исследуют на наличие углеводов и посредством пробы ио замедлению сахарозы на наличие ингибиторно-активных компонентов.

Фракции, содержащие ингибитор сахаразы, кроме того, тонкослойной хроматографией аналогично примеру 2 исследуют на содержание отдельных компонентов. Фракции, содержащие производное амипосахаров , соединяют, концентрируют и лиофилнзируют. Получают 35 мг производного аминосахароз с п с 0,3-105 ед. ИНГ. амилазы/г и 30000 ед. ИНГ. сахаразы/г.

Пример 7. В колбу Эрленмейера с 120 мл

питательной жидкости, состоящей из 5% крахмала, 1% дрожжевого экстракта, 0,2% К2ПРО4, засевают по 2 мл предварительной культуры по примеру 4. После трехдневной инкубации при 28°С получают культуральные

растворы со следующим выходом амилазного ингибитора (преимущественно состоят из производных аминосахаров с ).

Ингибитор

Штамм амилазы, ед/л

37000

SE 50

109000 SE 50/13

53500 SE 50; ПО

Пример 8. В колбу Эрлеимейера емкостью 1 л с 120 мл питательной жидкости, состоящей из 1,3% мальтозы, 3,5% глюкозы, 0,5% гидролизата казеина, 1,3% дрожжевого экстракта, 0,3% СаСОз, 0,3% К2ПРО4, засевают по 2 мл предварительной культуры по нримеру 4. После четырехдневно)) инкубаци при 24°С на качалках с различными штаммамн нолучают растворы со следующими выходами ингибиторов (преимущественно состояиз производных аминосахаров с ).

ШтаммИнгибитор саха-Ингибитор

разы, ед/мламилазы, едмл

SE 5025580

SE 50/1314,814(50

SE 50/11057,9755

Пример 9. В ферментер с 100 л питательной жидкости, состоящей из 3,5% глюкозы, 2,5% сухого порошка солодового экстракта,

0,5% гидролизата казеина, 1,3% дрожжевого экстракта, 0,3% СаСОз, 0.3% К.НРО н 0,1% антивспенивателя, засевают 5 л предварительной культуры по примеру 4 и при размешивании и проветривании в течение 5 дней инкубируют при 24°С. Получают культуральпый

раствор с 73000 ед. ипг. сахаразы/л, который

преимущественно содержит пропзводное амнпосахаров с /г 2.

90 л ферментационной жидкости с мицелием концентрированной азотной кислотой подII

кисляют до рН 2,5 и добавляют 900 г (1%) активированного угля (фирмы «Мерк) для адсорбции основного количества образовавшихся красителей. Перемешивают в течение 15 мин, центрифА гой ири 3000 об/мин отделяют мицелий и основное количество угля и остаток нри добавке 3 кг Clarcela фильтруют через иутч-фильтр, работаюндий иод давлением. Получают 65 л желто-коричневого, прозрачного фильтрата с 60000 ед. ииг. сахаразы/л, фильтрат концентрированным аммиаком доводят до рН 7 и для адсорбции активного вещества в течение 30 мин неремешивают с 1300 г (2%) активированного угля (фирмы «Мерк). Фильтруют через нутч, работающий иод давлением, и осадок активированного угля 3 раза иромывают 10 л дистиллированной воды. Затем уголь ирессуют досуха и три раза, каждый раз в течение 15 мин перемещивают с 4 л 50%-ного ацетона ири рН 2,5, чтобы десорбировать действующее вещество от угля. После удаления угля фильтрацией ацетоновые элюаты объединяют. Объединенный элюат унаривают до 250 мл, добавляют равный объем (250 мл) метанола и фильтпуют через складчатый фильтр. Фильтрат (480 мл) ири тщательном размещивании по каплям добавляют к 5 л ан,етона. Вычавщий осадок фргльтруют через путч и 3 раза промывают ацетоном и эфиром. Затем слппат в вакууме пои 35°С. Выход 230 г с 8500 ед. итгг. сахаразы/г. 25 г сырого продукта растворяют в 1 л воды и в течотпе 30 мин пепеменшвают с 300 г DowexR 50 AVX 4 П+ (200-400 мещ). Отфильтровывают СМОЛУ и три оаза промывают 2 л 0,001 и. HCI. Промытый Dowex затем суспендируют в 500 мл воды, и суспеизию добавлением 25%-пого раствора аммиака доводят до рН 9,0. Затем еще 2 раза десорбируют с 500 мл 0,6%-iToro раствора аммиака, элюаты объединяют и упаривают до 100 мл. Для обесцвечивания раствопа его в течение 5 мин перемешивают с 2 г DAE-целлюлозы (фирмы «иТлрйхер и ПТюль ЛЬ 02035, 0,6 мвалии/г) и затем центрифугируют. К светло-желтому остатку добавляют равный объем (100 мл) метанола и затем ппи ти1ателытом перемешивании по каплям добавляют 2 л ацетона. Оеадок фильтруют па путче, иромывают ацетоном и эфиром и при 35°С сушат в вакууме.

Выход 4,2 г с 26000 ед. инг. сахаразы/г. Для дальиейщей тонкой очистки 4,0 г ингибитора по порциям 0,5 г подвергают гель-фильтрации через биогель Р-2. Для этой цели 0,5 г препарата растворяют в 10 м.т ИаО и паиосят па колонну с биогелем Р-2 (200-400 меш, фирмы «Био-Рад) диаметром 5 см и длиной 95 см. Проявляют в воде ПРИ степени текучести 80 мл/ч. Собирают 12 мл фракции. У всех фракций оиределяют общее содержаиие углеводов (аитроповой пробой как экетинкция при Ев2о). а также содержание ингибитора сахаразы и амилазы. Кроме того, фракции подвергают тонкослойной хроматографии (окраска ингибитора ферментов по примеру 2).

12

Фракции, в которых находятся производные аминосахаров с л 4-6, объединяют, упаривают до 10 мл и осаждают прикапыванием к 200 мл спирта. Осадок удаляют центрифугироваиием, промывают ацетоиом и эфиром и сущат в вакууме; выход из 4,0 г еырого ингибитора: 0,2 г производного аминосахаров с п 4-6 с 17,5-10 ед. инг. амилазы/г и 8500 ед. ИНГ. сахаразы/г. Фракции, содержащие производное аминосахаров с л 3, обрабатывают тем же способом, причем осаждение ведут 200 мл ацетона; выход из 4,0 г сырого ингибитора: 0,1 г производного аминосахаров с « 3 с 1,4-106 ед. ИНГ. амилазы/г и

21 000 ед. ИНГ. сахаразы/г. Из фракций, содержащих производное аминосахаров с л 2 (осаждение ацетоном), выделяют 0,9 г производного аминосахаров с л 2 с 0,3-10 ед. инг. амилазы/г и 68000 ед. инг. сахаразы/г.

Пример 10. В три небольших ферментера, каждый из которых содержит 8 л питательной жидкости из 7,5% сухого порошка солодового экстракта, 0,3% гидролизата казеииа, 0,7% дрожжевого экетракта, 0,3%

СаСОз, 0,3% К2ПР04, засевают 5% предварительной культуры штамма SE 50/110 (получен согласно примеру 4). После пятидневной инкубации при 24°С получают культуральный раствор с 73 ед. инг. сахаразы/мл, который

преимущественно содержит производные аминосахаров с л 2.

После центрифугирования (30 мин, 3000 об/мин) для отделения мицелия, получают 20,5 л интенсивпо-коричневого кз тьтурального раетвора с 67000 ед. ипг. сахаразы/л. Добавлением азотной кислоты рН доводят до 3,5 и для обесцвечивация добавляют 60 г Lewapola (Са 9221, зернистость 0,35 мм, фирмы «Байер)/л 1,23 кг Lewapola. После двадцатиминутного перемешивания фильтруют через нзтч-фильтр Зейтца К 3. Обесцвеченный культуральный раствор нейтрализуют аммиаком (18,5 л, 67000 ед. ииг. сахаразы/л). Затем для адсорбции активного вещества добавляют 20 г активного угля/л 370 г и перемешивают в течение 30 мин, отфильтровывают через фильтр Зейтца К 3, на который был ианесеп слой фильтровального BcnoMoraTCvibnoro вешества Clarcel, фильтрат удаляют (17,5 л,

3600 ед. ииг. сахаразы/л). Угольный остаток три раза промывают 2 л дистиллированной воды. Для десорбции активного вешества от угля его поеледовательио 3 раза ио 15 мин иромывают I л 80%-ного ацетона, причем значение рН концентрироваиной ПС1 доводят до 2,5. Элюаты объединяют (2,4 л 371 000 ед.янг. сахаразы/л). К элюату добавляют 20 г дауэкса (Н+) (дауэкс 50 WX 4, Н+-форма, фирмы «Серва, Гейдельберг) 46 г дауэкса и перемешивают в течение 20 мии. Затем отфильтровывают смолу (фракция дазэкса I) и иромывают небольшим количеством 75%-ного ацетона. Фильтрат и промывную жидкость (3 л 215 000 ед. инг. сахаразы/л) смешивают

с 60 г амберлита IRA 410 (ОН--форма, фирмы «Серва, Гейдельберг)/л до установления значения рН 7. Затем отфильтровывают и к фильтрату (2,8 л, 219000 ед. инг. сахаразы/л добавляют 72 г дауэкса Н+ и перемешивают в течение 20 мин. Посредством висячего пористого найлонового мешочка, наполненного амберлитом IRA 410 ОН, значение рН поддерживают на 3,0. Затем отфильтровывают дауэкс (фракция дауэкса II) и удаляют фильтрат (2,6 л, 27000 ед. инг. сахаразы/л). Каждую из фракций I и II дауэкса 3 раза промывают 75%-ным ацетоном при рН 3,5 и затем три раза десорбируют 100 мл (фракция I дауэкса) или 150 мл (фракция И дауэкса) 0,6%-ным раствором аммиака. При первой десорбции, при которой количество аммиака было недостаточным для нейтрализации дауэксной смолы, значение рН доводят до 9 посредством конц. NHa. Три элюата фракций I и II дауэкса объединяют и упаривают досуха, растворяют в 50 мл воды, соляной кислотой доводят до значения рН 3-4 и добавляют 50 мл метанола. Растворы цри перемешивании по каплям добавляют к 1,5 л абсолютного ацетона, выпавший осадок фильтруют на путче и 3 раза промывают ацетоном и 1 раз эфиром. Сушат в вакууме. Выход: фракция I 65 г, 25000 ед. ингибитора сахаразы/г. Фракция II 12,3 г, 36000 ед. ингибитора сахаразы/г. Фракции I и 111 как ингибиторные компоненты преимущественно содерл ат производное амнносахаров с /г 2 наряду с небольшим количеством следующих высших гомологов (). В таблице приведены данные о полученных соединениях.

Пример 11. 200 г описанного в примере 1 препарата растворяют в 940 мл дистиллированной воды и в 60 мл конц. серной кислоты и в течение 4 час нагревают до кипения с обратным холодильником (внутрепняя температура 98-100°С; температура масляной бани 140°С). К охлажденному черно-коричневому раствору добавляют 10 г активного угля (фирмь1 «Мерк № 2186) и перемешивают в течение 1 часа. Затем активный уголь отсасывают, промывают водой и фильтрат примерно 250 мл 10 н. КОН доводят до рН 7-8. Раствор в течение часа перемешивают с 50 г активированного угля. Уголь отсасывают, промывают 2 л воды и фильтрат отделяют. Для десорбции

уголь в течение ночи дигерируют 2 л 30%-пого спирта. Затем отсасывают уголь и спиртовой раствор упаривают. Остаток 6,2 г. Сырой продукт (6,2 г) растворяют в 500 мл воды и в течепие часа осторожно перемешивают с 30 г амберлита IR 120 (П+-форма). Катионит фильтруют и промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции фильтрата. Затем ионит в течение ночи перемешивают с 15 мл 25%-ного аммиака в 1000 мл воды, отделяют и удаляют. Фильтрат упаривают. Остаток 3,7 г. Для дальнейшей очистки проводят хроматографию на целлюлозе. 4,5 г десорбированнего с ионита материала наносят на наполненную Целлюлозой колонку длиной 1 м и

15

шириной 2,5 см. В качестве элюеита применяют систему этаиол/вода 5 ; 1, для элюирования производиого амииосахаров с применяют этанол/вода 3:1. При скорости 20 капель в минуту собирают фракции по 14 мл. Отдельные фракции проверяют тонкослойной хроматографией.

После упаривания фракции 47-85 дают 1,6 г коричневатого производного аминосахаров с . Окрашенные примеси количественно не имеют никакого значения. Производное аминосахаров с л 1 получают как бесцветную смолу, если очистку проводят с сильнокислым ионитом не периодическим процессом, а на колонке.

Пример 12. 200 г описанного в примере 1 препарата растворяют в 940 мл дистиллированной воды и 60 мл конц. П28О4 и в течение 1/4 часа нагревают до кинения с обратным холодильником (внутренняя температура 98- 100°С; температура масляной бани 140°С). К охлажденному черно-коричневому раствору добавляют 10 г активированного угля (фирмы «Мерк, N° 2186) и перемешивают в течение часа. Затем отсасывают активированный уголь, промывают водой и фильтрат 250 мл 10 н. КОП доводят до рП 7-8. Раствор в течение часа перемешивают с 50 г активированного угля. Уголь отсасывают, промывают 2 л воды и фильтрат упаривают. Для десорбции уголь в течение ночи дигерируют 2 л 30%-ного спирта. Затем уголь фильтруют, и спиртовой раствор упаривают. Остаток 8,0 г.

Остаток растворяют в 15 мл ПаО и наносят на наполненную 50 г амберлита IR 120 (Н+-форма) колонку (высота 20 см, диаметр 2,4 см). Подают со скоростью 3 капли в 1 мнп и промывают водой (12 кагюль/мин) до удаления всех основных компонентов. Затем основные продукты 0,5%-ным аммнаком удаляют с колонки элюированием (12 капель/мин) и водный раствор упаривают досуха. Остаток 4,1 г.

2 г этого остатка растворяют в небольшом количестве воды и наносят на наполненную Sephadex G-15 колонку (высота 200 см, диаметр 3,0 см). Элюируют водой. При скорости 8 мл/час собирают фракции по 2 мл. Отдельные фракции исследуют тонкослойной хроматографией. Фракции 85-94 дают 280 мг производного амииосахаров с п 2 со специфической активностью 50000 ед. ииг. сахаразы/г.

Пример 13. 2 г ирепарата, описанного в примере 1, в 60 мл 20 мМ натрий-глнцерофосфатного буфера с рП 6,9 н I мМ CaCU нри постоянном перемешивании в течение 120 час при 37°С инкубируют 1 г а-амилазы из У зрегgillus spec, (фирмы «Серва, № 13418), затем в течение 5 мин нагревают до 100°С и нерастворимые части удаляют центрифугированием при 4000 об/мин. После лиофилизации раствора получают 1,9 г продукта с 350 ед. инг. сахаразы/г и 2-10 ед. ИНГ. амилазы/г. Если этот продукт исследуют тоикослойной хроматографией или посредством окраски ингибиции са16

харазы согласно примеру 2, то оказывается, что в качестве ингибиторно-активных соединений в основном получают производные аминосахаров с п 1, 2 и 3.

Пример 14. Если 2 г препарата, описанного в примере 1, в 30 мл 20 мМ ацетатного буфера с рП 4,8 при постоянном перемешивании в течение 120 час при 37°С инкубируют 1,25 мг р-амилазы из сладкого картофеля

(фирмы «Берингер 15471), затем в течение 5 мин нагревают до 100°С и нерастворимые части удаляют центрифугированием при 4000 об/мин, то после лиофилизации раствора получают 1,5 г продукта с 1800 ед. инг. сахаразы/г и 3,8-10 ед. инг. амилазы/г.

Если этот продукт исследуют тонкослойной хроматографией или посредством окраски ингибиции сахаразы согласно примеру 2, то оказывается, что в качестве ингибиторно-активных

соединений в основном получают производные аминосахаров с л 2 и 3.

Пример 15. Если колбу Эрленмейера емкостью 200 мл с 25 мл питательной жидкости, состоящей из 0,1% К2ПРО4, 0,2% (ЫП4)25О4,

0,05% MgSO4, 0,05% КС1, 0,01% FeSO4, 2% препарата, описанного в примере 1, засевают сзспензией спор штамма Asp. Niger АТСС 11304 и при 28°С инкубируют на качалке, то через 6 дней снижается титр с 210000 до

53000 ед. ИНГ. амилазы/мл и через 10 дней до 21 300 ед. ИНГ. амилазы/мл. Одновременно содержание ед. инг. сахаразы/мл с 7,0 повышается до 72 ед. ингибитора сахаразы/мл. 20 мл раствора, в течение 10 дней инкубированного суспензией спор, для отделения мицелия в течение 30 мин центрифугируют при 3000 об/мин. Из 15 мл остатка 72000 ед. инг. сахаразы/л) при 30-минутном перемешивании с 2 г амберлита IRC 50 Н+ и 1 г амберлита IRA 140 ОП удаляют соли (электропроводность менее 2 мсим). Раствор фильтруют и фильтрат с 5 мл/час пропускают через эквилибрированную дауэксом Н+ в 0,001 н. НС1 колонку (диаметр 1 смХЮ см), затем промывают 200 мл 0,001 н. ПС1. Для десорбции колонку промывают 0,6-ным раствором аммиака (10 мл/час) и собирают 5 мл фракции. Фракции, оказывающие ингибируюшее на сахаразу действие, упаривают до 2 мл и добавляют

2 мл метанола. Этот раствор доводят до рН 3-4 и для осаждения по каплям добавляют к 100 мл ацетона. Осадок фильтруют на нутче, промывают ацетоном и простым эфиром и сушат в . Выход 26 мг с 28000ед. инг.

сахаразы/г из производных аминосахаров с п 2 и 3. Чистое производное аминосахаров с п 2 получают из этого продукта, как описано в примере 9, гель-фильтрацией через колонку биогеля Р-2. Получают 7 мг производного аминосахаров с п 2 с 60000 ед. инг. сахаразы/г.

Пример 16. 2 л культурального фильтрата, получаемого из ферментационного раствора согласно примеру 6 удалением мицелия

центрифугированием при 13000 об/мин, име17

ющего активность 13000 ед. инг. сахаразы/г. для снижения содержания соли (электронроводность культурального фильтрата примерно 10 мсим) в течение часа неремешивают с 500 г смеси из 2,5 части амберлита ШС-50 (Н+-форма) и 1 части амберлита IRA-410 (ОН-форма), фильтруют, упаривают до 100мл и для удаления нерастворимых частей в течение 15 мин центрифугируют при 20000 ед/мин. Остаток доводят до 100 мл его электропроводность 3,5 мсим) и для дальнейшей очистки наносят на колонку (55X400 мм) с Р-целлюлозой (фирмы «Серва N° 45130; полученный известными способами и эквилибрированный в 5 мМ аммонийфосфатного буфера, рН 5,5). В качестве растворителя используют указанный фосфатный буфер (скорость 90 мл/час) и собирают фракции по 18 мл.

Фракции алюата проверяют на содержание углеводов (антроновая проба) и на ингибирующие сахаразу компоненты (пробой на ингибицию сахаразы), затем фракции, которые согласно антроновой пробе почти не содержат углеводов и одновременно согласно пробе с сахаразой оказались особенно активными (фракции 60-170), объединяют, упаривают до 150 мл и фильтруют через колонку (50X300 мм) с амберлитом IRA-410 (HCOj-форма). Для лучшего контроля деионизации элюат собирают по фракциям (10 мл на фракцию в 20 мин) и проверяют на углеводы (посредством антроповой пробы; почти отрицательно), на фосфат (посредством реактива аскорбиновой кислоты - молибдата: почти отрицательно) и на ингибицию сахаразы (посредством ферментативной пробы). Иигибиторно-активные фракции (3-30) собирают, концентрируют и лиофилизируют, повторно растворяют и лиофилизируют, причем получают 280 мг сырого ингибитора.

Для дальнейшей очистки сырой ингибитор согласно иримеру 6 фракционируют через биогель Р-2. Из фракций, содержащих чистое производное аминосахаров с , после лиофилизации получают 30 мг продукта с 0,3-10 ед. ИНГ. амилазы/г и 35000 ед. инг. сахаразы/г.

Пример 17. Для получения производных аминосахаров с п 5-7 исходят, например, из описанного в прмере 1 препарата.

Для этого 30 г препарата согласно примеру 1 растворяют в 250 мл Н20. Электропроводность этого раствора составляет 10 мсим, рН 5,5. Для обессоливания к раствору добавляют 60 г амберлита IRC 50 Н+ (слабокислый катионит, который только минимально связывает производные аминосахаров из водного раствора) и 20 г амберлита IRA 410 ОН- и перемешивают в течение 20 мин. Фильтрат (электропроводность 0,5 мсим, рН 3,5) посредством 1 н. НС1 доводят до значения рН 3,0 (электропроводность 0,6 мсим). Этот раствор с 42 мл/час пропускают через наполненную дауэксом 50 W+) (Н+) колонку (диаметр 2,5 см, высота 40 см, эквилибрировано в

18

0,001 н. MCI) и затем иромывают 2 л 0,001 н. НС1. После промывк) колонки элюируют 1,2%-ным водным и собирают 10мл фракции. Ингибпторно-активные фракции

объединяют, аммиак удаляют в вакууме и затем раствор упаривают до 30 мл. Осаждают прикапыванием в 600 мл спирта, осадок отфильтровывают на нутче и после промывки спиртом н эфиром сушат в вакууме. Выход

4,4 г с 26,5-10 ед. инг. амилазы/г.

По 0,5 г для тонкой очистки, согласно примеру 9, наносят на колонну с биогелем Р-2 и проявляют. Фракции, которые согласно тонкослойной хроматографии (окраска ингибиции

амилазы) содержат производные аминосахаров с п 5-7, объединяют, упаривают в вакууме и осаждают указанным способом спиртом. Выход из 0,5 г сырого продукта: 0,2 г производных аминосахаров с /г 5-7 с 30- Ю ед. ннг.

амилазы/г и 2500 ед. инг. сахаразы/г.

Пример 19 (пример кислой десорбции предлагаемых соединепий).

Колонку диаметром 1,5 см заполняют 30 г

сырого дауэкса 50WX4 (П+) 200-400 меш в 0,001 н. НС1. Затем примерно в течение часа через колонку пропускают смешанный элюат (400000 ед. ннг. сахаразы/л, рН 2,5, 60%-ного ацетона), полученный согласно примеру 10, и

затем промывают 500 мл 0,001 н. ПС1. В этих условиях элюируется только минимальная активность. Затем десорбируют 0,0125 н. ПС1, причем регистрируют электропроводность элюата колонки. Кроме того, исслед}ют на содержание ед. инг. сахаразы элюата. Активиые фракции 74-100 объединяют и нейтрализуют добавкой амберлита IRA 410 ОП-, затем упаривают до 5 мл, добавляют 5 мл метанола и осаждают добавкой но каиля.м к 200 мл ацетона. После промывки ацетоном и эфиром сушат в вакууме.

Выход 1 г производного аминосахаров с /г 2 с 65000 ед. ппг. сахаразы/г.

Из активных предварительных фракций получают производные аминосахара с п 3 и п 4.

Этот способ кислой десорбции в противоположность к основной десорбции позволяет

фракционировать гомологические производные аминосахаров.

Индивидуальность производпого аминосахара 1, где R - глюкоза, а подтверждена данными тонкослойной хроматографии,

п-1 газовой хроматографией его триметилсилнльного производного, - углом врашения.

Строение производного аминосахара 1, где R - глюкоза, а подтверждено

ИК-спектрамп, ЯМР-спектрами частично дейтерированных производных, масс-спектрами ацетнлированных п метилированных производных.

Строение высших гомологов подтверждено

продуктами деградации. Формула изобретения 1. Способ получения производных аминос харов общей формулы I НО, он н - ч Н он. OF где R означает олигосахарную цепь с гексозными единицами, отличающий тем, что организм семейства актинопланацей в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, соли, выращивают в аэробных условиях при рН от 5,0 до 8,5 с носледующим выделением целевого продукта известными приемами. 2.Способ по п. 1,0 т л и чающийся тем, что как микроорганизм семейства актинопланацей берут организм вида актинопланес. 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что водная питательная среда содержит антивспениватель.