БИБЛИОТЕКА Советский патент 1973 года по МПК C12P7/46 

1

Изобретение отн-осится к .микробиологической яромышленности.

Известен способ получения 2,6-нафталиндикарбоноВОЙ кислоты (НДКК) химическим путем прямым окислением 2,6-диметилнафталина (ДМН).

Предлагаемый способ получения 2,6-нафталиндикарбоновой кислоты является более простым 1ПО .сравнению € известным.

Он дает возможность проводить окисление при помощи микроорганизмов рода Pseudomonas, выращенных на Среде, содержащей глюкозу в качестве И|сточника углерода, в частности вид putida штамм Р, а также микроорганизмы рода Nocardia, выращенные на среде, содержащей в качестве источника углерода н-алканы, в частности вид ораса щтамм 264А. Процесс окисления ведут при атмосферном давлении при температуре 28- 30° С без образования побочных продуктов.

Пример 1. Культуру Pseudomonas поддерживают на мясопептонном агаре (МПА), выращивают в течение суток на среде МПА и суспензию .выроощей культуры высевают в колбы Эрленмейера на 250 мл с жидкой средой, разлитой по 50 мл.

Состав среды следующий, мл:

К2НРО410,0

КН2Р041,0

NH4NO32,0

MgS04-7H2O

FeSO47HaO

СаСЬ-бНгО

CuS04-5H20

НзРОз

ZnS04-H.,O

MnS04-H20

Na2MoO4-2H2O

СЬ-бНгО

СоСЬ-бПоО

Глюкоза

Одновременно с следовые количества 2,6-ДМН и после инкубации в течение 20 час при 30° С в коябах на качалке вносят 30 мг 2,6-ДМН. Ферментация заканчивается спустя 48 час. Культуральную жидкость центрифугируют при 10000 об/мин, упаривают досуха на роторном испарителе при 50° С. Сухой остаток экстрагируют 10%-ным раствором уксусной кислоты в диэтиловом эфире для удаления неиспользованной глюкозы. К сухому остатку после экстракции добавляют 25%-ный раствор NH4OH. Нерастворимый остаток отфильтровывают и отбрасывают. Фильтрат подкисляют ледяной СНСООН до рН 6,0 и оставляют на холоде. Выпавшие кристаллы аммонийной соли 2,6-НДКК отфильтровывают, промывают небольшими порциями дистиллированной воды и используют для идентификации. Идентичность аммонийной соли выделенной кислоты с аммонийной солью известной 2,6-НДКК установлена методами ИК-а 1Ф спектроскопии (1Ф-спектр А-шах 277±1; 286±1; 297+1 растворитель аммиак-изопроланол 6: 1) и методом тонкослойной хроматографии на окиси алюминия в системе метанол : аммиак : диметилформамид 2:2:1 Rf - 0,28 и на силикагеле (Silufol) в системе абсолютный этанол: аммиак 15:1, Rf - 0,31. Т. пл. свыше 300° С с разложением.

Пример 2. Культуру Nocardia поддерживают на агаризованной среде Бушпель-Хааса с гексадексаном -в качестве источника углерода, выращивают в течение двух суток и суспензию выросшей, культуры высевают -в колбы Эрленмейера на; 250 мл с жидкой средой 8-Е, разлитой по 50 мл.

Состав среды, г/л:

MgSOi-THaO0,8

NaCl0,5

КН2РО40,7

(NH4)2HP04- 1,5

Вода водопроводная до 1 л.

КН2РО4 и (NH4)2HPO4 стерилизуются отдельно на дистиллированной воде.

Гексадекан добавляется дробно в течение трех дней в количестве 10 г/л.

Через 24 час после инокулиравання в среду вносят 50 мг 2,6-ДМН. Процесс трансформации прослеживают с помощью хроматографии. Окисление прекращают на пятые сутки, культуральную л идкость упаривают досуха на роторном испарителе -при 55° С, осадок обрабатывают эфиром для удаления парафина и алкилнафталина. Остаток растворяют в аммиаке, прогоняют через колонку с окисью алюминия, элюируя кислоту с колонки смесью аммиака и пропилового спирта, экстракт упаривают досуха и получают аммонийную соль 2,6-НДКК кислоты. Идентичность аммонийной соли выделенной кислоты с аммонийной солью известной 2,6-НДКК установлена методами ИК-а И 1Ф спектроскопии (1Ф-спектр Хшах 277 ± 1, 286±1, 297 + 1, растворитель-аммиак : изопропанол 6:1) и методом тонкослойной хроматографии на окиси алюминия в системе метанол : аммиак : диметилформамид 2:2:1, Rf - 0,28 и на силикагеле (Silufol), в системе абсолютный этанол: аммиак 15: 1, Rf - 0,31. Т. пл. свыще 300°С с разложением.

Характеристика штамма Р. Выделен из почвенных образцов, взятых на территории Запорожского коксохимического завода в местах загрузки нафталина.

Культуральные признаки. Колонии на твердых питательных средах гладкие, плоские, блестящие, бесцветные или серовато-белые. На стандартной среде, предложенной Kimeg-etal образует флюоресцирующий пигмент.

Морфология культуры. Клетки палочковидные с округленными концами, 1,5-3,0x0,,

подвижные с двумя-тремя полярными жгутиками, грамм-отрицательные.

Экологические признаки. Растет при 4° С, оптимум роста при , не растет при 41° С. Физиологические признаки. Растет на обычных питательных средах, на синтетических средах растет предпочтительнее с нитратной формой азота, чем с аммиачной. Желатину не разжижает, молоко не изменяет, индол не продуцирует. Культура обладает запахом 3-метиламина. Нитраты восстанавливает.

Биохимические признаки. Трансформирует ароматические соединения нафталинового ряда в соокислительных условиях.

Характеристика штамма 264А. Выделен из активных илов Ангарского нефтеперерабатывающего завода.

Культуральные признаки. Колонии на мясопептонном агаре пастообразные, гладкие,

блестящие, розово-палевые; колонии на суслоагаре-слизистые, водянистые, розоватые.

Морфология культуры. 24-часовая культура на мясопептонном бульоне имеет вид крупных палочек и нитей, искривленных с отчетливым

ветвлением, длина отдельных клеток до 20 ц,. Через двое суток культура распадается накокковидные фрагменты и имеет вид конгломератов из кокков.

Экологические признаки. Растет при температуре от 4 до 28° С, при значении рН от 5,0 до 9,0 растет при концентрации солей в среде

до 5,0%.

Физиологические признаки. Строгий аэроб, растет на синтетических средах с добавлением комплекса витаминов группы В, усваивает глюкозу, галактозу, ксилозу, арабинозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, лактозу, раффинозу, маннит, глицерин, этанол, ацетат, бутират, лактат, сукцинат, фенол в качестве источников углерода.

Не усваивает пропионат, цитрат, бензоат. В качестве источников азота усваивает нитратные и аммонийные соли, мочевину, аспарагин, пептон, гидролизат казеина. Нитраты восстанавливает, ассимилирует н-парафин от октана до гептадекана включительно.

Биохимические признаки. Обладает каталазной активностью, пероксидазной не обладает,

экстрацеллюлярную линазу не синтезирует,

желатину, казеин, целлюлозу и крахмал не

гидролизует.

Трансформирует ароматические соединения бензольного и нафталинового ряда в соокислительных условиях.

Предмет изобретения

1. Способ получения 2,6-нафталиндикарбоновой кислоты путем окисления 2,6-диметилнафталина, отличающийся тем, что, с целью

упрощения процесса, окисление проводят при

помощи микроорганизмов. 5 2.Способ по л. 1, отличающийся тем, что используют .микроорганизмы рода Pseudomonas, выращенные на среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода. 3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем,5 что КЗ рода Pseudomonas используют вид putida штаым Р. б 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют микроорганизмы рода Nocardia, выращенные на среде, содержащей в качестве источника углерода н-алканы. 5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что из рода Nocardia используют вид ораса штамм 264А.