Способ получения @ -маннаназы Советский патент 1982 года по МПК C12N1/14 C12N15/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ а -МАННАНАЗЫ

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству ферментных препаратов, и касается фермента а маннаназы, которая может быть использована в научно-исследовательских биохимических и химических лабораториях в качестве аналитического препарата при устаиовлении структуры маннанов, а также для гищ)олиза маннанов и маннозосодержащих биополимеров при различных технологических процессах, когда их присутст- , вие нежелательно, в частности при получении биологически активных веществ их дрожжей, при гидролизе высокополимериых углеводсодер-. жащих веществ в винах и пр.

Известен способ получения фермента, расщепляющего дрожжевой машин, с помощью культуры Arthrobacter G-IM, .хранящейся в коллекции живых культур лаборатории биохимии Калифорнийского университета (Беркли, 20 США), питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли и воду, в уо ловиях аэрации. Продуцент синтезирует внеклеточную маннаназу на среде состава, в г/л:

Дрожжевой маннан1,0

Аммоний сернокисль1й0,5

Магний сернокислый0,2

Железо сернокислое закисное 0,01

Кальций хлористый

0,05

двухводный 0,5

Дрожжевой экстракт

Калий фосфорнокислый

7,54

даузамещенный

Калий, фосфорнокислый

2,32

однозамещенный До 1 л и

Вода

Ферментация проводится при 30 С на качалке в течение 36 ч. Маннаназная активность культуральной жидкости составляет 5-6 ед/мл.

15

Недостатком этого способа является применение в качестве продуцеита «-маннаназы недоступного для Использования в нащей стране штамма микроорганизма из рода Arthrobacter,

Цель изобретения - повышение активности целевого продукта и его удешевление.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения а-маннаназы путем культивирования микроорга1дазма продуцента 3, 958 на питательной феде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли и воду, в условиях аэрации, в качестве продуцента используют штамм Nocardia erythropolis ИМВ-19 а в качестве источника углерода - клетки пекарских дрожжей в количестве 10-20 г/л. Штамм ИМВ-19 выделен из лесной почвы в районе г. Киева. Хранится в центральном музее промышленных микроорганизмов, ВНИИГенетика под номером ЦМПМ S-555. Штамм имеет следующую характеристику. Морфологические признаки. Культура N.ery- thropolis ИМВ-19 не образует воздушного мицелия. При росте на органических средах клетки 14-16-часовой культуры представляоот собой длинные тонкие прямые или слегка нскривленные палошси, иногда разветвленные. К 24 часам роста клетки становятся палочками средних размеров (6-8 мк х 0,6-1,0) „ по шляются кокки. К 36 часам роста наблюдается преобладание кокковидных клеток. Клетки ве имеют капсул и эндоспор, неподвижные, грамположительные, слабо кислотоустойчивые. На агаризованных органических средах рост культуры N.erythropolis ИМ1В-19 обильный, колонии гладкие, блестящие, пастообргсвные, бледнорозовые. При росте в МПБ культура образует муть и обильный осадок. Культуральные и биохимические свойства к Штамм N.erythropolis ИМВ-19 растет при 10-40°С (оптимальная температура 28°С при значениях рН среды 6,0-10,0 в аэробных условиях. Предлагаемый в качестве продуцента а -маннаназы микроорганизм способен расти на средах с 5% NaCt, но не растет при 7% зтой соли в среде. В гидролизатах клеток этого штамма обна-. ружены в больших количествах арабиноза, галактоза и глюкоза, а также мезодиаминопимели новая кислота и характерный гщя нокардий липид LCN-A. Культура N.erythropolis ИМВ-19 (Жраживаетс образованием кислоты глюкозу, сахарозу, ксилозу, маннозу, рамнозу, фруктозу, глицерин маннит, сорбит и не сбраживает арабинозу, галактозу, лактозу, мальтозу, раффинозу, сорбо зу, салицин, дульцит и метил-D-глюкозид. Штамм N.erythropolis ИМВ-19 способен использовать в качестве единственного источ1шка углерода натриевые соли лимонной, молочной, пировиноградной, уксусной, янтарной и бензойной кислот, а также дрожжевые а -маннаны.. Найтрий виннокислый и и авелевокисльш культурой не утилизируются. Микроорганизм растет на средах с аммонийными солями в качестве истоадика азота, Штамм не пептонизнрует молоко, не разжижает желатину, не гищ)олизует крахмал, нитрат йосстанавливает до Нитритов слабо, образует ирозиназу, каталазу, р-нитрофенолоксидазу. На звестной полусинтетической среде при глубином выращивании синтезирует внеклеточную маннаназу. . Активность к 36 часам выращиания составляет 10-17 ед/мл культуральной идкости. Сущность способа состоит в том, что штамм .erythroJMjIis ИМВ-19 вырагцивают на среде, тличающейся от описанной выше и использоавшейся для выращивания продуцента в-мананазы из рода Arthrobacter, а именно на среде, одержанхей вместо дрожжевого маннана в каестве источника углерода клетки пекарских рожжей и имеющей состав, г/л: Клетки пекарских дрожжей10-20 Аммоний сернокислый0,2-0 Магний сернокислый0,2 Кальций хлористый двухводный0,03-0,05 Калий фосфорнокислый двузамещенный7 4 Калий фосфорнокислый однозамещенньга.. Вода водопроводнаяДо 1 л рН7,0-7 Замена в среде дс огосгоящего и трудно нарабатываемого в лаборатортшпс условиях маннана клетками пекарских дрожжей и устранение из нее дрожжевого экстракта делает среду экономически более выгодной и более доступной для изготовлений. Предлагаемый, способ полуэдния а-маннаназы состоит из двух стадий. Стадия i . Выращивание инокулюма. Питательную среду засевают 1маточной культурой N.erythropolis ИМВ-19, выращенной на плотной среде состава, г/л воды: Клетки пекарских дрожжей /3,0 . Аммоний сернокислый0,5 Магний сернокислый0,2 Кальций хлористый .0,05 Железо .сернокислое закисное0,01 Калий фосфорнокислый двузамещенный7,54 Калий фосфорнокислый однозамещенный2,32 Дрожжевойжстракт .0,5 Агар-агар15-20 Выращивание инокулюма проводят в жидкой среде, состава, г/л воды: Клетки пекарских щюжжей10,0 Аммоний сернокислый0,5 Магний сернокислый0,2 Кальций хлористый двухводный0,05 Калий фосфорнокислый двузамещенный7,54 5958498 Калий фосфорнокиотый одиозамещенный2,32 рН7,0-7.2 Выращивание проводят в 0,5-литровых колбах со 100 мл феды на качалке с 220 -. 240 об/мин в течегае 24-30 ч при 27-29°С. Стадия 2. Биосинтез а-маннаназы. В 0,5-литровые колбы, содержащие 100125 мл аналогичной среды с дрожжевыми кцетками (состав ее приведен выше), вносят 5% fo к объему среды инокулюма. Ферментацию ведут на. качалке с 220-240 об/мин при 27-29° С в течение 36-40 ч. Активность культуральной жидкости к этому времени составляет 10- 17 ед/мл, в 5-7 ч она остается ста- is . бильной, затем начинает медленно снижаться. Активность а-маннаназы определяют по нарастанию количества редуцир5тощего сахара (маннозы) в инкубационной смеси, содержащей исследуемый материал (культуральную 20 жидаость), субстрат (маннан пекарских (дрожжей) и соответствующий Зуфер. За едию1цу активности принимают такое количество фермента, которое обуславливает образование 1 мкмоля маннозы при гидролизе маннана в условиях опьпа за 1 ч. Количество редуцирующего сахара (маннозу) определяют по методу Нельсона-Сомоги. Фермент из культуральной жидкости выделяют известным способом. Полученный с помощью N.erythropolis ИМВ-19 препарат а-маннаназы катализирует гидролшз а-мананов по связям 1,2 и 13 с отщеплением маннозы. Использование предлагаемого способа может бь1ть проиллюстрировано следующими примерами. Пример 1. Выращивание инокулюма щтамма N.erythropolis ИМВ-19 и ферментацию проводят на среде, предложенной для синтеза маннаназы микроорганизмом из рода Arthrobacter в 0,5-литровых колбах, содержащих по 100 мл среды, на качалке с 240 об/мин. Колбы для выращивания инокулюма засевают 2-суточной культурой N.erythropolis ИМВ-19 выращенной на агаризованной среде того же состава, и инкубируют их 24 ч при 28° С. За- . тем посевной материал (инокулюм) в количестве 5% к объему среды вносят в ферментацнонные колбы и ведут инкубацию 36 ч при той же температуре. К концу ферментафсн активность культуральной жидкости составляет 2,6 ед/мл. Вь1деление а-маннаназы из культуральной жидкости осуществляют известным способом. П р и м е р 2. Выращивание инокулюма проводят на той же среде и в тех же условиях, что и в примере 1. Ферментацию проводят на феде состава, г/л воды: ви жи 13 ра (п и ны ки в ко и на цу пр в 1 th тав но на N. ре Сухие клетки пекарскнх дрожжей10,0 Аммоний сернокислый.0,5 Магний сернокислый0,2 Кальций хлористый двухводный0,05 Калий фосфорнокислый двузамещенный7,54 Калий фосфорнокислый однозамещенный232 рН7,0 Выращивание культуры проводят в услох примера 1. .Активность культуральной дкости к концу ферментации составляет ,7 ед/мл, т. е. в 5 раз выше, чем при выивании прод пдента на среде с маннансм имер 1). Пример 3. Выращивание инокулюма ерментацию проводят в условиях, приведенх в примере 1, на среде, содержащей клетпекарских дрожжей (состав среды приведен римере 2). Активность культуральной жидсти к концу ферментации составляет 17 ед/мл. П р и м е р 4. Вьфащивание инокулюма ерментацию проводят в условиях примера 1 среде состава, г/л воды: Клетки пекарских дрожжей10,0 Аммоний сернокислый0,2 Магний сернокислый0,2 Кальций хлористый двухводный0,03 Калий фосфорнокислый двузамещенный7,54 Калий фосфорнокислый однозамещенный232 Активность культуральной жидкости к конферментации (40 ч) составляет 10,6 ед/мл. Пример 5. Выращивание инокулюма водят на среде, приведенной в примере 2, словиях примера 1. Ферментацию проводят в условиях примера а среде состава, г/л воды: Клетки пекарских дрожжей20,0 Аммоний сернокислый0,2 Магний сернокислый0,2 Кальций хлористый0,03 Калий фосфорнокислый двузамещенный7,54 Калий фосфорнокислый однозамещенный232 Активность культуральной . жидкости N.ery- opolis ИМВ-19к концу ферментации сосляет ед/мл. Сравнительная характеристика а -маннаназактивности щтамма N.erythropolis ИМВ-19 различных средах приведена в таблице. Таким образом, предлагаемый штамм rythropolis ИМВ-19 при выращивании на омендованной среде с дрожжевыми клетками

7958498g

проявляет более высокую (в 2-3 раза) ог-ман- по сравнению г известным в литературе пронаназнуго активность при удешгёвленни сретл,центом этого фермента Arthrobacter G-IM-1.

Ф о р м ула изобретения

Способ получения а-маннаназы путем культивирования микроорганизма продуцента на питательной среде, содержащей источник углерода, 25 азота, минеральные соли и воду, в усцрвиях аэрации, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого про/дукта и его удеигевления, в качестве продуцента используют штамм Nocardia erythropolis ИМВ-19, а в качестве источника углеродаклетки пекарских дрожжей в количестве 10- 20 г/л.

Источника информации, принятые во внима гае при экспертизе 1. Jones G. Н., Ballon С. Е. Isolation of an a-mannosidase whichhidroltsed yeast mannan. Structure of the backbone of yeast mannan.- J. Bfol. Chem. 1968, 243, 9, p. 24422446.