ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Советский патент 1973 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 

1

Изобретение относится к области ветериларии.

Известно использование питательной среды для выращивания микроорганизмов, приготовленной из мяса, рыбы, частично из казеина.

Однако такие питательные среды дороги, трудоемки в приготовлении, нестандартны, так как мясо для этих целей чаще всего используется мороженое.

Предлагаемая питательная среда для выращивания бруцеллезных микробов с целью увеличения концентрации микробных тел, обладающих длительной жизнеспособностью и иммуногенными свойствами, содержит гидролизаты из обрата молока и казеина, в ее состав введен кукурузный экстракт и компоненты взяты в следующем количестве (на 1 л), гидролизата обрата молока и казеина (ка амин«ый азот) 100-120 мг/°/о в равных соотношениях, пептона сухого 5 г, поваренной соли 5 г, глицерина 10 мл, глюкозы 10 г, кукурузного экстракта 5-7 мл (в зависимости от содержания процента фосфора), водопроводной воды до 1 л.

приготовление гидролизата из обрата. 1 л обрата молока подогревают до 45° С, подщелачивают 20%-ным раствором соды (ГхаНСОз) до рН 7,8 и добавляют 1 г сухого панкреатина или 10 г измельченной поджелудочной железы крупного рогатого скота.

Фермент предварительно разводят в небольшом количестве теплой водопроводной воды. Через 15-20 мин после внесения панкреатина или поджелудочной железы добавляют

10 мл хлороформа, затем бутыли закрывают резиновыми пробками, завернутымн в марлевые салфетки, и ставят в термостат при 40° С на четверо суток. Содержимое бутылей перемеШИвают через каждые 5-б час.

В процессе гидролиза ел едневно проверяют рП н, в случае снижения его до 7,2-7,4, снова подщелачивают 20%-;ным раствором воды до рН 7,6-7,8. Пробку после встряхивания бутылей слегка приоткрывают для удаления паров хлороформа. Через 4 суток бутыли вынимают из термостата, содерл нмое фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают нейтральный рН или слабощелочной (7,0-7,2), стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.

Хранят при 5-8° С в бутылях, закрытых резиновой пробкой, и используют но мере надобности для приготовления питательных сред. В готовом гидролизате должно содержаться аминного азота 400-500 .«г/%, оби.;егэ азота - 700-800 лгг/%.

Приготовление гидролизата из казеина. Берут 1 кг пищевого кислотного казеина ТУ-15354, заливают 10 л дистиллированной яли Бодопроводной воды, подогретой до 40° С,

Б };оторой предварительно растворяют 100 г

углекислого натрия (NaaCOs). Казеин тщательно перемешивают до полного растворения, поддерживая при этом температуру около 40° С, добавляют 300 г фарша поджелудочной железы, устанавливают рН 7,6-7,8 20%ным раствором едкого натра (NaOH) и добавляют 100 мл (%) хлороформа. Гидролиз ведут при 37° С в течение 14-16 суток, при этом содержимое бутылей ежедневно перемешивают и коитролируют рН, который должен быть в пределах 7,4-7,6. Регулируют рН 20%-ны;м раствором едкого натра.

В конце гидролиза рН снижается до 7,0-7,2, а амидный азот повышается до 700- 900 жг/%. Если аминный азот достиг указанного уровня, бутыли охлаждают до комнатной температуры, затем на трое суток помеш,ают в холодильник при 5-7° С для отстаивания. Отстоявшийся гидролизат декантируют и фильтруют через ватно-марлевый фильтр или полотно бельтинг. К остатку нерасшепленных белков прибавляют дистиллированной или водопроводной воды столько, сколько было декантировано гидролизата, затем подкисляют соляной кислотой до 1рН - 6,3 и кипятят в течение 10 мин. После кипячения охлаждают, отстаивают, фильтруют сначала через вату, потом через полотно бельтинг.

Обе порции фильтратов смешивают, консервируют прибавление.м 1 % хлороформа, хранят при 5-7° С в бутылях, закрытых резиновой пробкой, и используют по мере надобности для приготовления питательной среды.

В готовом гидролизате должно содерл аться, жг/%:

Аминного азота 700-850,

Обшего азота 1100-1200.

Приготовление жидкой обрато-казеиновой питательной среды.

Компоненты среды взяты в следующих количествах на 1 л:

Гидролизата обрата молока и казеина (да алшнный азот) в равных соотнощениях 100-120 .

Пептона (сухого)5 г

Поваренной соли (NaCl)5 г

Глицерина Q мл

Кукурузного экст1ракта (в зависимости от его качества)5-7 мл

Глюкозы на сухое вещество10 г

Водопроводной водыдо 1 л

Примечание: При добавлении 2,5-3,5% агарагара получают плотную среду. Прк добавлении 1,5-1,7% агар-агара получают среду, пригодную для определения количества живых бруцелл в сухой бруцеллезной вакцине культуральным методом.

До стерилизации смесь перечисленных компонентов подщелачивают 10%-ным раствором едкого натра и устанавливают рН до 6,7-6,8. После стерилизации в готовой среде

рН должен быть 6,5-6,6. Количество необходи.мого гидролизата для приготовления 1 л среды в расчете на амииный азот вычисляют по формуле:

5V « 1000

л мл,

где а - количество мг1% аминного азота, необходимого для приготовления среды;

b - количество лгг/э/о аминного азота, содержащегося в применяе.мом гидролизате;

X - искомое количество гидролизата.

,.гг 100- 1000 „„„

1оПример. 200 мл; или

оОи

„ 120 1000 ... 500 -240л....

Определяе.м, какое количество гидролизата обрата следует взять на 1 л среды, если в нем содержится лг/Vo аминного азота. В данном случае 200 мл, но так как его

берут в равном соотношении с гидролизато.м из казеина, то следует взять на 1 л ореды 100 мл.

Все компоненты среды, за исключением глюкозы, смешивают в варочном котле, подщелачивают 10%-ным раствором едкого натра до рН 6,7 - 6,8. Смесь кипятят при помешивании до полного растворения всех компонентов, затем к смеси прибавляют горячую водопроводную воду до первоначального

объема. Готовую среду фильтруют через фильтр-пластины и одновременно перекачиваЕот в реактор для стерилизации. Стерилизуют среду при 120° С (1 атм) 40-45 мин. После стерилизации в жидкой среде рН

должен быть 6,4 - 6,6.

По сравнению с мясными средами, предлагаемая среда имеет более однородный состав белка. Готовая ареда по содержанию а.минокислот приближается к полусинтетической и

используется для выращивания микробов без пеногасителя, так как при культивировании почти не пенится. Использование достаточно полного набора аминокислот в среде обеспечивает полноценное физиологическое и морфологрмеское развитие микробной клетки, что обусловливает сравнительно высокий выход микробной м.ассы с единицы объема питательной среды, т. е. 55-60 млрд микробных тел в 1 мл, а в лабораторном реакто)ре с автоматическим регулированием рН накопление микробной массы составляло 70-80 млрд микробных тел в 1 мл по бруцеллезному стандарту мутности при наличии высокого процента живых бруцелл типичной морфологии.

В целях подтверждения стабильности результатов по накоплению микробной массы, получаемой при глубинном выращивании бруцеллезной культуры, готовят шесть серий

ферментативного гидролизата из обрата (2, 4,

6, 7, 8, 9) и три серии ферментативного гидролизата казеина (1, 3, 5), из которых в дальнейшем готовят жидкую питательную среду для глубинного культивирования вакционного штамм.а бруцелла абортус 19. Как опытная, так и контрольная среда содержит 100-120 уиг/% аминного азота; в обоих средах после стерилизации устанавливается рН 6,4 - 6,6 (для жидкой среды). В качестве контроля используют гидролизат Хоттингера и пептон MiapTcna, применяемый обычно в производстве. Материалом для засева реакторов служит 36-часовая бруцеллезная культура производственного вакционного штамма № 19. Посевная доза составляет не менее 100-150 млн микробных тел на 1 мл питательной среды по бруцеллезному стандарту мутности ГКИ.

Перед засевом реактора в среду стерильно добавляют глюкозу в виде 40%-ного раствора из расчета 0,5% к объему среды. Культуру выращивают при 36-37° С в реакторах ем.костью 480 л, содержащих 100-250 л среды. Аэрацию осуществляют подачей стерильного воздуха из расчета 1,5-2 л воздуха на 1 л/лшн среды механическим перемешиванием со скоростью 260 об/мин. Выращивание продолжается в течение 32-34 час.

В процессе выращивания бруцеллезной культуры определяют рН среды. Для поддержания на определенном уровне рН через 16-18 час культивирования в среду повторно добавляют глюкозу в количестве 0,2-0,5 г. Через 24-32 или 34 час отбирают пробы, в которых определяют оптическую концентрацию микробной взвеси цо бруцеллезному стандарту мутности количество живых бруцелл цветным методом с помощью краски метиленовой сини.

Каждую пробу взвеси бруцелл контролируют па чистоту роста и типичность морфологии путем просмотра под микроскопом окрашенных по Граму мазков, а также высевом на питательные среды и бульон).

Чистую культуру бруцелл осаждают в течение 18-24 час, цадосадочную жидкость удаляют. Концентрированную микробную массу сливают в стерильные баллоны, определяют оптическую концентрацию микробных тел в 1 мл, затем добавляют в зависимости от полученной концентрации среду высушивания. Из полученной стерильной микробной массы готовят сухую живую бруцеллезную вакцину (в соответствии с требо ваниями инструкции по изготовлению и контролю сухой живой бруцеллезной вакцины).

Как показывают исследования, выращивание вакцинного бруцеллезного штамма 19 в жидкой обрато-казеиновой среде не оказывает влияния на его морфологию, антигенные и иммуПОгенные свойства. При длительном хранении (18-25 мес.) в сухой вакцине сохраняется высокий процент живых бруцелл, типичных по своей морфологии.

6

В опытах па морских свинках устанавливают высок}Ю иммуногенность сухих вакцин серий (1, 4, 14, 15), полученных из культур, Быращен.ных на предлагаемой среде.

Результаты сравнительного испытания интенсивности роста вакцинного бруцеллезного штамма 19 на обрато-казеиновом, мартеновском и хоттингеровско: 1 бульонах при глубинном методе выращивания приведены в таблице.

20

25

30

Оптическая концентрация бруцелл определяется по бруцеллезному стандарту мутности; кол ичество бруцелл - цветны.м методом с помощью краски метиленовой сини. Накопление мимробной массы с 1 мл среды в среднем в два раза больше, чем на средах из мясных гидролизатов.

Высушивают 15 экспериментальных серий из вакционного штам,ма бруцелла абортус 19. В качестве контроля высушивают 12 серий бруцеллезной вакцины, изготовленной из культур, выращенных на плотной агаровой среде, основу которых составляют мясные гидролизаты.

На основании регулярных сравнительных исследований сухой бруцеллезной вакцины, хранящейся при 4-6° С в течение 18-25 мес. со дня изготовления, зстанавливают, что вакцина сохраняет морфологические, антигенные и иммуногенные свойства. Вакцина, полученная из культур, выращенных в жидкой среде, по своему качеству не уступает вакцине, выращенной на агаре. Эта вакцина вполне отвечает требованиям действующей инструкцил по изготовлению и контролю сухой живой бруцеллезной вакцины.

При добавлении 2,5-3,5% агар-агара к жидкой обрато-казеиновой среде, получается плотная агаровая среда, которая может быть использована в производстве для выращивания вакцинного штамма бруцелла абортус 19. Накопление микробной массы на плотной обрато-казеиновой среде на 15-20% больше, чем на агаровой печеночной и мясной средах. При проверке на стабильность в пробе с трИпа:фтави.но.м и в реакции термопреципитации бруцеллезной культуры вакцинного штамма 19, хранившейся в пробирках на скошенном обрато-казепновом агаре при 4-6° С в течение 3 мес. (время проверки), культура этого штамма остается стабильной и не имеет признаков диссоциации. При испытании той же культуры, сохранившейся в тех же условиях на печеночно-глюкозо-глицериновом и мартеновском агарах, в пробе с трипафтавином отмечается положительная реакция агглютинации, что доказывает (наличие диссоциации. Для плотной среды рН до стерилизации устанавливают 7,1-7,2, стерилизуют при 115° С в течение 30 мин. Эта же среда может быть использована для определения количества живых бруцелл в бруцеллезной вакцине, если к жидкой обрато-казеиновой среде добавить 1,5-1,7% агар-агара. 8 Предмет изобретения 1.Питательная среда для вь раш;ивания кроорганиамов, например бруцелл, содераш,ая .пептон, поваренную соль, глицерин, юкозу, отличающаяся тем, что, с целью еличения концентрации микробных клеток, ладающих длительной жизнеспособностью иммуногенными свойствами, она содержит дролизаты из обрата молока и казеина. 2.Среда по п. 1, отличающаяся тем, что, целью ускорения процесса деления микробй клетки (бруцелл), в нее введен кукурузй экстракт. 3.Среда по пп. 1 и 2, отличающаяся тем, о ее компоненты взяты в следующих колиствах (на 1 л среды): Гидролизата обрата молока и казеина (на аминный азот) 100-120 лгг/О/о в равных соотношелиях Пептона сухого Поваренной соли Глицерина Глюкозы Кукурузного экстракта в зависимости от содержа5-7 мл ния процента фосфора до 1 л.Водопроводной воды