Питательная среда для диагностики бруцеллеза Советский патент 1993 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики бруцеллеза человека и животных,

Целью изобретения является улучшение ростовых свойств питательной среды для бруцелл, удешевление состава среды и расширение сырьевой базы для приготовления основы питательной среды.

Это достигается путем применения в качестве основы питательной среды ферментативного гидролизата из плацентарно- эмбрионально-маточных тканей (отходов производства мясокомбинатов) от убойного крупного рогатого скота и свиней или смеси гидролизатов этих тканей, которые составляют в общем объеме убойного скота мясокомбинатов от 80 до 90%. В питательную среду для выращивания бруцелл в качестве

белковой основы вводится ГПЭМ - гидролизат из плацентарно-эмбрионально-маточ- ных тканей стельных коров и свиней (в отдельности или вместе взятых в равном объеме) при следующем оптимальном соотношении ингредиентов, мае. %: Гидролизат плацентарно-эмбриональноматочный (сухой остаток

9-10%)1,4

Натрий хлористый, хч 0,5

Глюкоза медицинская 1,0

Глицерин3,0

Агар-агар2,0

Вода дистиллированная Остальное

Среду кипятят 5-10 мин, фильтруют, разливают в пробирки, колбы, стерилизуют, рН готовой среды составляет 7,2-7,3.

Предлагаемый гидролизат, являясь продуктом глубокого расщепления белков, соел С

00

о о

00

О

со

держит широкий спектр аминокислот, играющих важную роль в метаболизме бруцелл, являющихся аминогетеротрофными микроорганизмами. Кроме того, указанный гидролизат является источником стимулятора роста бактерий за счет содержания в своем составе биологически активных веществ плацентарной ткани.

Пример 1, Гидролизат плацентарно- эмбрионально-маточный готовят следую- щим образом: ткани плаценты, матки, мягких тканей эмбриона, полученные на мясокомбинате после убоя животных (не позднее 2-3 часов) подвергают ферментативному гидролизу; к 1 кг измельченной на мясорубке ткани добавляют 1,5 л кипящей воды, перемешивают, подщелачивают 20% раствором щелочи (едкий натр) до рН 8,0, подогревают до 70°С. В отстуженную до 40- 45°С смесь добавляют 150 г фарша подже- лудочной железы или 20 г панкреатина с активностью 45 ЕД, добавляют 22,5 мл хлороформа, емкость герметично закрывают и ведут гидролиз при периодическом перемешивании 4-5 суток при , поддер- живая рН смеси на уровне 7,4-7,6. По окончании гидролиза гидролизат переливают в емкость из нержавеющей стали, кипятят 15 мин. при рН 5,0, отстаивают, фильтруют, стерилизуют, подвергают лио- фильному высушиванию. В гидролизате определяют общий и аминный азот, уровень пептидов.

Готовый продукт должен соответствовать биохимическим показателям, отражен- ным в табл. 1, из которой видно, что гидролизаты из плацентарно-эмбриональ- но-мэточных тканей коров и свиней мало отличаются друг от друга, а по величинам общего и аминного азота превосходят про- тотип - гидролизат кильки,

Пример 2. Для изучения ростовых свойств питательной среды для бруцелл на основе гидролизата плацентарно-змбрио- нально-маточного проводились опыты по титрации компонентов питательной среды в зависимости от роста микроорганизмов - известных вирулентных тест-штаммов бруцелл (3 вида рода:-бруцелл, 7 биотипов), полученных из ГИСК им. Тарасёвича, типичных по морфологическим, культурально-биохи- мическим и серологическим свойствам: бруцелла абортус 544; бруцелла суис 1330; бруцелла мелитензис 25; (референтные штаммы) и бруцелла абортус штаммы 271- 2803; 276-720; 275-138; 280-381-К-4 (полевые штаммы).

Для приготовления микробных взвесей суточные культуры тест-штаммов смывали 0,9% раствором хлористого натрия, доводили взвесь до содержания 1 млрд/мл микробных клеток по оптическому стандарту мутности, затем серийными десятикратными разведениями доводили до содержания 1 тыс. (101 и 100 (10 ) микробных клеток в 1 мл взвеси. И.з разведения и 10 взвеси каждого штамма культуры бруцелл высевали по 0,1 мл на чашки Петри с предлагаемой и известными средами. Учет результатов проводили через 72-96-144 часов инкубации посевов при 37°С.

Результаты указанных исследований при разном соотношении компонентов питательной среды на основе ГПЭМ представлены в табл. 2, из которой следует, что при испытании 7 известных вирулентных штаммов бруцелл установлены граничные концентрации компонентов по составу предложенной среды. При этом по наибольшему количеству выросших колоний за оптимальную концентрацию компонентов состава питательной среды авторами принято, мае. %:

Гидролизат плацен- тарно-эмбрионально- маточный (сухой остаток 9-10%)1,4 Натрий хлористый, х.ч. 0,5 Глюкоза медицинская 1,0 Глицерин 3,0 Агар-агар 2,0 Вода дистиллированная Остальное Граничные с ним минимальные концентрации составляют, мае. %: Гидролизат плзцен- тарно-эмбрионально- маточный (сухой остаток 9-10%) 1,2 . Натрий хлористый, х.ч. 0,4 Глюкоза медицинская 0,9 Глицерин 2,75 Агар-агар 1,75 Вода дистиллированная Остальное Граничные с ним максимальные концентрации составляют, мае. %: Гидролизат плацента рно-эмбрионально- маточный (сухой остаток 9-10%) . i;e Натрий хлористый, х.ч. 0,6 Глюкоза медицинская 1,1 Глицерин 3,25 Агар-агар 2,25 Вода дистиллированная Остальное Предложенная питательная среда на основе гидролизата плацентарно-эмбрио- нально-маточного по оптимальных концентрациях компонентов по своим ростовым свойствам не уступает составам питательных сред по прототипу.

Пример 3. Проводились специальные исследования по изучению ростовых свойств питательных сред для вирулентных штаммов бруцелл при использовании в качестве основы среды гидролизата плацен- тарно-эмбрионально-маточного из тканей коров (б), свиней (в) в отдельности и смеси указанных гидролизатов в равном соотношении (1:1, г). Результаты опытов представлены в табл. 3, из которой видно, что по своим ростовым свойствам среды, по предлагаемому изобретению на основе исследованных гидролизатов (б, в, г) практически не отличались друг от друга, по количеству выросших колоний были близки к среде по прототипу, агару Д, однако превосходили его по ускоренному росту колоний бруцелл (на 1-2 суток) и большим размером колоний. Морфологические, тинкториальные и дифференцирующие свойства бруцелл, выращенных на средах по прототипу и предлагаемому изобретению, оставались неизменными.

Пример 4. По определению диагностической эффективности оптимального со- става в сравнении с прототипом исследовался патологический материал от крупного рогатого скота (к.р.с.), экспериментально зараженного бруцеллезом, и материал из неблагополучных хозяйств от поголовья крупного рогатого скота, реагирующего положительно на бруцеллез по РА и РСЖ (колхоз Ередви Цхинвальского района Юго-Осетинской АО). Эффективность питательных сред определялась по количе- ству выделенных культур бруцелла абортус в процентах к количеству исследованных проб (лимфатические узлы: паховые, подчелюстные, заглоточные, шейные, околоушные, тазовые, предлопаточные, коленной складки, портальный, бронхиальные, пара- аортальные; яичники, костный мозг, печень, селезенка). Результаты отражены в табл. 4, из которой видно, что по эффективности предложенная питательная среда на основе ГПЭМ превосходит среду по прототипу на 7,0-10,7%%.

Технико-экономическая эффективность данного предложения заключается в следующем: 1) на питательной среде по изобретению в сравнении с прототипом ускоряется на 1-2 суток рост культур бруцелл; 2) повышается диагностическая эффективность по количеству выделенных колоний возбудителя бруцеллеза из патологического материала (на 7,0-10,7%%); 3) расширяется сырьевая база непищевого белка для изготовления питательной основы сред с использованием отходов производства мясокомбинатов, годовой объем которых только на одном мясокомбинате (г. Казань) составляет 50-60 тонн; 4) в значительно меньшей стоимости сырья - плацентар- но-эмбрионально-маточного материала (в 3-7-9 раз) в сравнении с общепринятыми в микробиологической практике источниками белка (рыба-печень-мясо) и экономии дефицитных пищевых мясоры- бо продукте в.

Все сказанное обусловливает возможность промышленного изготовления для нужд бактериологических лабораторий основы питательной среды для выделения бруцелл в лиофилизированном состоянии.

Формула изобретения Питательная среда для диагностики бруцеллеза, содержащая питательную основу, агар-агар, натрий хлористый, глюкозу, глицерин и дистиллированную воду, о т- личающаяся тем, что, с целью ускорения диагностики за счет повышения ростовых свойств среды, в качестве питательной основы она содержит ферментативный гидролизат плацентарно-эмбрио- нально-маточных тканей коров и/или свиней при следующем соотношении компонентов, мае. %:

Гидролизат плацен- тарно-эмбрионально- маточных тканей коров и/или свиней1,2-1,6 Натрий хлористый 0.4-0,6 Глюкоза 0,9-1,1 Глицерин 2,75-3,25 Агар-агар 1,75-2,25 Вода дистиллированная Остальное

Таблица 1

Использование: ветеринарная и медицинская микробиология, бактериологическая диагностика бруцеллеза. Сущность изобретения заключается в том, что в питательную среду в качестве белковой основы (источника аминного, общего азота) вводится ферментативный гидролизат из отходов производства мясокомбината - плацентар- но-эмбрионально-маточных тканей от коров и свиней как в отдельности, так и в виде их смеси при следующем соотношении ингредиентов, мае. %: гидролизат плацентарно- эмбрионально-маточных тканей (с сухим остатком 9-10%) 1.2-1,6; натрий хлористый 0,4-0,6; глюкоза медицинская 0,9-1,1; глицерин 2,75-3,25; агар-агар 1,75-2,25; вода дистиллированная остальное. 4 табл,

Обозначения: а- контропь - агар Л из гидролиэата кильки

в - агар ив основе гидролиаата из ллацентарно-энбрионэльно-маточных тквнви коров

(ГПЭН коров)

g - . -- свиней (ГПЭМ свиней)- - г - н« основе сиеси гидролизатое ГПЭМ коров и свиней (ill)

Таблица

Таблица}

Таблица4