Штамм бактерии BRUceLLa авоRтUS, используемый для изготовления вакцин против бруцеллеза Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 A61K39/10 

стью, безвредностью, и слабой агглютино- генностью, неабортогенностью.

Сущность изобретения. Новый штамм Br.abortus 21-5 получен из штамма Br.abortus 21 путем пассажирования через организм стельных коров и отселекциони- рован в стабильных Р - формах.

Штамм Br.abortus 21-5 депонирован в лаборатории контроля и стандартизации бруцеллезных и кампилобактериозных препаратов ВГНКИ.

Штамм Br.abortus ВГНКИ № 20-1-ДЕП характеризуется следующими культураль- но-морфологическими и физиолого-биоло- гическими признаками.

Морфологические: клетки штамма 21-5 представляют коккабактерии 1-1,5 мкм в длину , по Граму отрицательны, по Козловскому сохраняют красный цвет, по Романовскому - нежно-фиолетовый.

Культуральные: бактерии штамма 21-5 хорошо растут на глюкозно-глицериновом печеночно-пептонном бульоне и агаре Д и других средах, имеющих нейтральную или слегка щелочную реакцию (рН 6,8-7,2) в аэробных условиях при температуре 37° С. На плотной среде образуют выпуклые, матовые, полупрозрачные колонии.

Биохимические: штамм 21-5 представлен Р - (100%) колониями, при окраске по Уайт-Вилсону реакция с трипафлавином положительна; с Р - сывороткой агглютинируют; сероводород не образует, каталазная активность незначительная, не ферментирует глюкозу, лактозу, маннит, рамнозу, инозит. Растет на среде с содержанием фуксина, а при аналогичном содержании ти- онина рост не отмечается.

Серологические признаки: не вызывает агглютининов и комплементсвязывающих веществ в диагностических титрах. Агглютинируется R-сывороткой.

Биологические признаки: непатогенен, неабортогенен (безвреден), приживаемость на морских свинках при дозе 100 м.к. до 2-х мес., 2 млрд.м.к. - до 3 мес, пассажирован через организм пяти стельных коров и десятикратно через организм морских свинок. Миграцией на привитых животных не обладает.

Иммуногенные признаки: иммуноген- ность в эксперименте на морских свинках составила 63,6-83.3%, на крупном рогатом скоте 75%.

I. Отличительные признаки штамма Бруцелла абортус 21-5:

а) слабая агглютиногенность. При прививках лабораторных животных и крупного рогатого скота не вызывает образования агглютиннов и комплементсвязывающих веществ в диагностических титрах;

б)высокая иммуногенность у морских свинок до 83,3% через 3 месяца, а на крупном рогатом скоте до 75% спустя год после прививок;

в)непатогенен: безвреден (неабортогенен). Приживаемость у морских свинок при дозе 100 м.к. до 2 мес., 2 млрд м.к. до 3 мес;

0 г) от вакцинированных животных на невакцинированных не мигрирует.

II.Отличие штамма Br.abortus 21-5 от близких штаммов

Штамм Br.abortus 21-5 отличается от сла- 5 богглютиногенного штамма Br.abortus 82 меньшей остаточной вирулентностью (отсутствием абортогенности), отсутствием сохранения агглютининов и комплементсвязывающих веществ.

0 Отличается от агглютиногенного штамма № 19 отсутствием агглютиногенности, что позволяет отличать постинфекционные реакции от поствакцинальных.

III.Пределы варьирования признаков 5 (5-10%)

Селекционирован в Р-форме из пятикратно пассажированной через организм стельных коров культуры.Рост на глюкозно- глицериновом МПА наблюдается в виде

0 100% колоний, содержащих Р-формы бру- целл по антигенным свойствам.

П р и м е р 1. Вакцинный штамм Бруцелла абортус 21-5 получен следующим образом. Методом неоднократных воздействий

5 ультрафиолетовыми лучами из вирулентной культуры вначале получен штамм 21. Затем проведен пассаж культуры штамм 21 через организм 5 стельных коров (сроки от 3 до 8,5 мес). Дозы вакцины от 100 млрд (1-я корова),

0 2-3 коровы по 200 млрд, 4-я - 220 млрд, 5-я - 300 млрд. Спустя один месяц от вакцинированных неделей, выделяли культуры штамма Br.abortus, которых изолировали из региональных лимфатических узлов, пред5 лдлаточных и надвыменных. Из 5-го пассажного варианта селекционирован вакцинный штамм 21-5 в Р-форме.

П р и м е р 2. Методика изготовления и контроля вакцины из штамма Бруцелла

0 abortus 21-5. Культуру штамма 21-5 засевают в пробирки с мясопептонным глюкозно- глицериновым агаром, имевшим рН 6,8-7,0. После двухсуточного культивирования в термостате при 37°С в каждую пробирку

5 вносят по 2 мл физраствора и смазывают бактериальную массу. Делают посевы на матровые колбы со скошенным мясо-пеп- тонным глюкозоглицериновым агаром (МПГТА). Поверхность агаровой пластинки тщательно увлажняют засеянной суспензиэй и матровые колбы помещают в термостат. После двухсуточного выдерживания при 37°С колбы вынимают и проводят визуальный осмотр с целью выявления загрязнения посевов. Затем в каждую колбу вносят по 40-50 мл физраствора и тщательно смывают бактериальную массу. Из смыва каждой колбы готовят мазки, окрашивают их по методу Грама, Козловского и микро- скопируют для проверки чистоты смывов. Колбы, в которых обнаруживают постороннюю микрофлору, выбраковывают, а из остальных полученную взвесь сливают в мерный цилиндр для определения общего объема смыва.

При установлении концентрации бру- целл вакционного штамма 21-5 в полученной взвеси используют оптические стандарты мутности.

Доводят концентрацию бруцеллезных клеток до 10 млрд в 1 мл. После этого вакцину расфасовывают в стерильные флаконы по 250 мл, заливают пробки сургучом и хранят в холодильнике при 5°С до употребления.

Помимо оптической устанавливают и биологическую концентрацию вакцины.

Определение проводят путем приготовления последовательных разведений исходной взвеси с оптической концентрацией 10 млрд. м.к. в 1 мл в пробирках с 4,5 мл физраствора до получения конечного разведения .1:100 с последующим посевом 0,1 мл каждого из двух последних разведений (1:100 и 1:1000) на 3-4 чашки Петри с глю- козно-глицериновым агаром из рыбного гидролизата. Посевы выдерживают в термостате при 37°С в течение 4-6 дней, после чего проводят подсчет выросших колоний. Определяютсреднее арифметическое число живых бруцелл, содержащихся в 1 мл каждого разведения. Полученные цифры складывают и делят на 2 (количество разведений). Данное число отражает среднее количество живых клеток, содержащихся в 1 мл приготовленной вакцины.

До употребления вакцину проверяют также на чистоту роста и безвредность. Чистоту

культуры проверяли микроскопическим исследованием мазков, приготовленных из полученной вакцины и окрашенных по методам Грама и Козловского. Кроме того, еще проводится высев на пластины МПГТА в чашки Петри для исключения загрязнения вакцины аэробными микроорганизмами. Из подозреваемых колоний готовят мазки, окрашивают и микроскопируют.

Загрязненность анаэробными микроорганизмами исключается высевом вакцины на среду Китт-Тароцци.

Безвредность проверяют подкожным введением вакцины двум беременным морским свинкам в дозе 1 млрд м.к. с последующим наблюдением за ними и исследованием от них сывороток крови через 2 недели в РА и РСК. Абортов и положительных результатов серологических реакций, как правило, не отмечалось. Данные приведены в таблице.

Тестами для определения диссоциации

служит трипафлавиновая проба, реакция термопреципитации и окраска колоний, выросших на пластине агара в чашках Петри по Уайту и Вилсону.

Трипафлавиновая проба и реакция термопреципитации всегда были положительными.

Окраской колоний кристаллвиолетом по Уайту и Вилсону обнаруживали до 100% шероховатых R-форм колоний.

Как видно из таблицы, штамм Бруцелла абортус 21-5 по иммуногенным свойствам превосходит коммерческий штамм Бруцел- ла абортус 19.

Формула изобретения Штамм бактерий Brucella abortus ВГНКИ № 20-1-ДЕП, используемый для изготовления вакцин против бруцеллеза.

f

Сравнительные данные по иммуногенности противобруцеллезных вакцин

Использование: микробиология, профилактика бруцеллеза, вакцина против бруцеллеза. Сущность изобретения: вакцину готовят из нового штамма Brucella abortus ВГНКИ№20-1-ДЕП. Штамм отличается низкой остаточной вирулентностью отсутствием абортогенности и агглютиногенности. Для получения вакцины штамм выращивают, отделяют клетки, доводят их концентрацию до 10 млрд.кл/мл и расфасовывают. Вакцина по иммуногенным свойствам превосходит вакцинный штамм 19 и не вызывает образования агглютининов, что позволяет постинфекционные реакции от поствакцинальных. 1 табл. (Л С Недостатком прототипа является то, что вакцинный штамм 19 обладает высокими аг- глютиногенными свойствами, вызывает у привитых животных серопозитивные реакции, которые трудно отличить от серопози- тивности у зараженных животных и вызывает аборты у стельных коров. Цель изобретения - получение штамма бруцелл для создания вакцины, обладающей высокой стабильностью, иммуногеннох| о XI ю о