СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 A61K39/10 C12R1/01 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к изготовлению вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота.

В настоящее время для профилактики бруцеллеза овец и коз широко используют вакцину, изготовленную из штамма Brucella melitensis Rev-1.

Выращивание штамма Rev-1 при изготовлении вакцины проводят на триптиказо-соевом агаре, агаре Альбими, сывороточно-декстрозном агаре (см. Дж. Альтон, Л.М. Джонс «Методы лабораторных исследований по бруцеллезу», ВОЗ, Женева, 1968, стр. 77-79). Ингредиенты, входящие в первые две среды, в нашей стране не выпускают, а применение агара-заменителя Альбими в производстве вакцины нерационально из-за недостаточного выхода бакмассы. На других питательных средах (печеночные, мясные, картофельные среды, эритритагар, агар Д и т.д.), применяемых для культивирования бруцелл (см. кн. “Бруцеллез”, под ред. П.А. Вершиловой, М., 1961, стр. 208-210), штамм Rev-1 растет плохо и диссоциирует.

Известен способ получения живой вакцины из штамма В.melitensis Rev-1, заключающийся в выращивании его на сывороточно-декстрозном агаре на основе мясо-пептонного бульона (см. Производство вакцины Rev-1. G.G. Alton WHO/Bruc. 70.321; Питательная среда для изготовления вакцины из штамма B.melitensis Rev-1. Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротестсистем. Мат. междунар. науч. конф., посвящ. 70-летию НПО «Питательные среды», Махачкала, 1998, с. 116-117). Недостатком данного способа является необходимость добавления в питательную среду перед засевом культуры бруцелл штамма Rev-1 до 10% стерильной сыворотки крови животных, а также то, что основой среды служат мясной бульон и пептон.

Изготовление питательной среды на основе высокоценного пищевого продукта - мяса экономически не оправдано, а добавление дефицитной и дорогостоящей сыворотки крови, помимо экономической нецелесообразности, вызывает дополнительные трудности, связанные со стерильным внесением ее в готовую среду и возможностью загрязнения вакцины посторонней микрофлорой.

Целью настоящего изобретения является разработка способа изготовления живой вакцины против бруцеллеза овец и коз из штамма Rev-1, состоящей из типичных для данного штамма однородных клеток бруцелл в S-форме и не имеющей диссоциированных микроорганизмов с использованием питательной среды, изготовленной из непищевого сырья и без добавления сыворотки крови животных.

Поставленная цель достигается тем, что для изготовления вакцины с целью увеличения выхода микробной массы и во избежание диссоциации бруцелл, культуру штамма В.melitensis Rev-1 выращивают на питательной среде, основой которой является панкреатический гидролизат казеина с добавлением в качестве источника витаминов и других ростовых факторов экстракта кормовых или хлебных дрожжей.

Питательная среда состоит из равных объемов панкреатического гидролизата казеина глубокой степени расщепления и экстракта дрожжей, разведенных после смешивания дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг % с добавлением 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы, 2% глицерина и 2-3,5% агар-агара. При выращивании на такой питательной среде достигается лучший рост бруцелл штамма Rev-1, больший выход бактериальной массы без диссоциированных клеток и обладающий лучшей жизнеспособностью, а также высокими иммуногенными свойствами.

Приготовление гидролизата казеина

Сухой казеин в количестве 1 кг заливают 10 литрами теплой дистиллированной воды, подщелачивают до рН - 8,5-9,0 и оставляют на несколько часов для разбухания. Затем при постоянном перемешивании подогревают до 80-90°C и температуру в этих пределах поддерживают до растворения казеина. В процессе растворения казеина рН смеси снижается, и поэтому периодически добавляют 20% раствор щелочи (NaOH) для поддержания рН на уровне 8,5-9,0 до полного растворения казеина.

Полученный раствор остужают до 45°C и к нему добавляют 50-100 г в зависимости от активности, панкреатина или же фарш поджелудочной железы крупного рогатого скота в количестве 0,5-1 кг.

Гидролиз проводят в течение 3-4 часов при температуре 45°C при постоянном перемешивании, поддерживая рН на уровне 8,5-9,0. Содержание аминного азота в готовом гидролизате должно быть 600-800 мг %.

При медленном гидролизе и содержании аминного азота менее 600 мг % панкреатин добавляют повторно.

По достижении аминного азота до 600-800 мг % гидролиз прекращают добавлением 100-120 мг уксусной кислоты.

Гидролизат кипятят в течение 10 минут, после чего его охлаждают и оставляют до следующего дня для отстаивания.

Отстоявшийся гидролизат декантируют и фильтруют через ватно-марлевой фильтр.

Приготовление экстракта дрожжей

Берут 1 кг светлых сортов кормовых или прессованных пекарских дрожжей и добавляют к ним 10 литров дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают, кипятят в течение 10-15 минут и в горячем виде фильтруют до прозрачности.

Приготовление питательной среды

Для изготовления среды смешивают панкреатический гидролизат казеина и экстракт дрожжей в равных количествах и разводят дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг %.

Смесь подогревают и после закипания к ней добавляют предварительно вымоченный в воде в течение 12 часов Корсаковский агар-агар высшего или первого сорта из расчета 3-3,5% для четвертей или матровых колб и 2% для пробирок и чашек.

После полного расплавления агар-агара в среду вносят 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы и 2% глицерина, доводят рН до 7,2-7,3 и, периодически перемешивая, ее кипятят еще 10-15 минут. Затем питательную среду фильтруют через ватный или полотняный фильтр, разливают в матровые колбы, четверти или другие необходимые емкости и стерилизуют при температуре 110-112°C в течение 30 минут.

После стерилизации матровые колбы ставятся в горизонтальном положении для застывания агара, а четверти обкатывают для распределения питательной среды по всей их внутренней поверхности.

До засева вакцинной культуры питательную среду в колбах, четвертях, чашках и пробирках выдерживают в течение 48 часов при температуре 37°C для подсушивания поверхности и контроля стерильности.

Выращивание культуры

Выращивание культуры Rev-1 для получения вакцины проводят на вышеуказанной питательной среде в матровых колбах, четвертях, пробирках или других емкостях.

Для засева серии вакцинной культуры проводят предварительную расплодку штамма в пробирках, матровых колбах или четвертях.

Вначале производственный штамм Rev-1 засевают в пробирки на косой агар. Берут одну пробирку 3-4-суточного роста эталонной культуры, разводят стерильным буферным раствором рН 6,6-6,8 так, чтобы получилась концентрация 10^-6 и 10^-7.

Из каждого разведения 0,1 мл культуры штамма засевают по 3 бактериологические чашки.

Через 5 суток выращивания в термостате при температуре 37°C чашки просматривают на чистоту и типичность роста культуры, проверяют морфологию клеток и на диссоциацию методом окраски колоний по Уайт -Уильсону.

При отсутствии диссоциации из неокрашенных, бактериологических чашек отбирают типичные колонии, которые отсевают на пробирки с косым агаром. После выдерживания посевов в течение 48 часов в термостате при температуре 37°C и проверки на чистоту культуру пересевают на требуемое количество пробирок с той же питательной средой. Пробирки выдерживают в течение 48 часов при температуре 37°C. Из этих пробирок получают рабочие культуры штамма Rev-1, используемые для засева очередных серий вакцины.

Пробирки с рабочей культурой штамма Rev-1 хранят в запаянном виде в холодильнике при температуре +4-8°С и пригодны для использования в течение 30 дней.

Для получения взвеси клеток с целью засева серии вакцины необходимо рабочие культуры размножить в нужном количестве в пробирках, матровых колбах или четвертях, смыть стерильным, забуферным (рН 6,6-6,8) физраствором так, чтобы получилась концентрация 2-3 млрд микробов, тел в 1 мл по оптическому бруцеллезному стандарту мутности. Такой расплодкой в количестве 4-5 мл засевают матровые колбы (матрасы) или четверти данной серии.

Выращивание культуры B. melitensis Rev-1 для получения вакцины на вышеуказанной питательной среде проводят в течение 72 часов при температуре 37°С. Выросшую вакцинную культуру, с поверхности агара, смывают средой высушивания.

Среду высушивания готовят следующим образом: в 1 литре кипящей дистиллированной воды растворяют 15 г желатина, после ее растворения добавляют 100 г сахарозы. Затем кипятят 5-6 минут, доводят рН до 7,2-7,3, фильтруют через полотняный фильтр, стерилизуют при 1 атмосфере 30 минут. После стерилизации среда должна иметь рН 6,8-7,0.

В каждую колбу или четверть вводят такое количество среды высушивания, чтобы концентрация бакмассы была в пределах 80-140 млрд микробных тел в 1 мл.

Суспензию бруцелл, полученную из колб или четвертей сливают в общую бутыль. После проверки на чистоту и диссоциацию расфасовывают в ампулы по 2 или 4 мл и подвергают лиофильной сушке.

Предлагаемый способ изготовления вакцины обеспечивает, по сравнению с существующим, увеличение выхода препарата в 1,2-1,3 раза. Полученная при этом вакцина состоит из однородных клеток в S-форме, типичной для штамма Rev-1 морфологии, и не имеющих признаков диссоциации.

Пример

Предлагаемая питательная среда, изготовленная на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта дрожжей, разлитая по 250,0 мл в 10 матровых колб, была испытана для изготовления живой вакцины против бруцеллеза овец и коз из штамма B. melitensis Rev-1.

Для сравнения результатов культуру штамма B. melitensis Rev-1 для изготовления вакцины выращивали и на сывороточно-декстрозном агаре на основе мясо-пептонного бульона с добавлением 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота. Данную питательную среду разливали в матровые колбы также по 250,0 мл в каждую колбу. Засевали культурой B. melitensis Rev-1 10 матровых колб со средой.

Культуру B. melitensis Rev-1 на обеих питательных средах выращивали при температуре 36-37°С в течение 72 часов. Основные данные, характеризующие результаты использования обеих питательных сред для выращивания штамма B. melitensis Rev-1 и изготовления из этого штамма вакцины против бруцеллеза овец и коз, представлены в следующей таблице.

Таблица. Основные результаты выращивания культуры штамма Brucella melitensis Rev-1 для получения бакмассы и изготовления вакцины против бруцеллеза овец и коз при использовании испытуемой питательной среды (новый вариант) и ранее применявшейся питательной среды (старый вариант).

Таким образом, в результате проведенных исследований по испытанию предлагаемой нами питательной среды, изготовленной на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей, установлены пригодность данной среды и целесообразность ее применения для выращивания штамма B. melitensis Rev-1 при изготовлении из этого штамма живой вакцины против бруцеллеза овец и коз. При этом показано, что применение указанной питательной среды позволяет получить бакмассу бруцелл штамма Rev-1 типичной для данного штамма морфологии в S-форме, не содержащую диссоциированных микробных клеток и 1,2 раза больше, чем при применении сывороточно-декстрозного агара, изготовленного на основе мясопептонного бульона с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота из штамма Brucella melitensis Rev-1. Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота предусматривает посев и выращивание штамма Brucella melitensis Rev-1 на питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина глубокой степени расщепления, экстракта дрожжей, натрий хлористый, глюкозу, глицерин и агар-агар в заданном соотношении компонентов в течение 72 часов при 37°C. Выросшую вакцинную культуру смывают с поверхности агара средой высушивания и доводят до концентрации 80-140 млрд м.к. в 1 мл. Проверяют на чистоту и диссоциацию, расфасовывают в ампулы и подвергают лиофильной сушке. Изобретение позволяет увеличить выход штамма Brucella melitensis Rev-1 в S-форме. 1 табл., 1 пр.

Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота, включающий посев и выращивание бруцелл штамма B. melitensis Rev-1 на питательной среде, состоящей из равных объемов панкреатического гидролизата казеина глубокой степени расщепления и экстракта дрожжей, разведенных после смешивания дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг % с добавлением 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы, 2% глицерина и 2-3,5% агар-агара, их смыв, разбавление средой высушивания до содержания 80-140 млрд микробных клеток в 1 мл, расфасовку в ампулы и лиофильную сушку.