Способ получения протеолитических ферментов Советский патент 1974 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение относится к ферментной промышленности.

Известны способы получения протеолитических ферментов путем культивирования их продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота.

В качестве продуцентов при известных способах используют термофильные грибы, относящиеся к виду Mucor pusillus, Myriocoe cum albomyces и др.

Предлагаемый способ позволяет получить более термостабильные протеолитические ферменты.

Для этого в качестве продуцентов используют термофильный гриб, относящийся к виду Torula thermophila, в частности щтаммУзПТ-1.

Штамм Torula thermophila УзПТ-1 целесообразно культивировать на водной питательной среде, содержащей 20% спиртовой зерновой барды и 1, крахмала.

Предлагаемый способ заключается в том, что щтамм Torula thermophila УзПТ-1 культивируют на водной среде, содержащей источники углерода и азота при рП среды 5,0-9,0, преимущественно 5,2-5,5, и температуре 28- 56°С, преимущественно 40-50, в течение 2- 4 суток.

В качестве источника углерода в среде могут быть использованы глюкоза, сахароза.

мальтоза, лактоза, маннит, глицерин, декстрин, инозит, крахмал.

В качестве источника азота может быть использован органический азот в виде пептона, кукурузного экстракта, дрожжевого автолизата, желатины, казеина, гемоглобина, яичного альбумина.

Пример 1. Штамм гриба Torula thermophila Уз-ПТ-1 культивируют на водной питательной среде, содержащей 20% (объемных) спиртовой зерновой барды и 1,5-2% крахмала при рП-5,5 и температуре 45-50°С в течение 2-3 суток.

Протеолитическая активность полученной культуральной жидкости составила 1,5- 2,5 ед/мл.

Пример 2. Штамм гриба Torula thermophila УзПТ-1 культивируют при рП 5,2-5,5, температуре 45-50°С в течение 3-4 суток на среде, содержащей, г:

КН2Р041

MgSO40,5

КС10,5

FcSO40,01

Крахмал30

Кукурузный экстракт20.

Среда также содержит до 100 мл воды. При этом получают культуральную жидкость, Протеолитическая активность которой по методу Ансона составляет 600-700-10 на 1 мл. Из культуральной жидкости протеолитические ферменты могут быть выделены путем осаждения их этанолом в соотношении 1:4 5 или высаливанием сернокислым аммонием при 70%-ном насыщении. Выход и активность полученных препаратов представлены в таблице.

Из таблицы видно, что хотя выход препарата при высаливании сульфатом аммония и небольшой, активность сохраняется полностью. Следовательно препарат получается в 8- 10 раз более очищенным, чем при осаждении этанолом.

Культуральная жидкость и ферментные препараты активны в пределах рН 4-12. Однако в кислой области протеолитическая активность значительно ниже, чем в щелочной. Максимум при рН 10-11.

Ири 50°С фермент утрачивает активность на 50% за 6 час и на 76% за 24 час. При 56°С активность теряется на 50% за 1 час и на 75% за 6 час. При 60°С фермент инактивируегся на 50% за 15 мин и полностью за 1 час 30 мин. При 65°С активность исчезает за 55-60 мин (опыты проведены при рН 10). Протеолитические ферменты мезофильного гриба Aspergillus flavus (Закиров М. 3., Умирзаков Б., 1966) полностью инактивируются в течение такого же времени при 55°С (при рН 4,5).

Характеристика штамма Torula thermophila УЗПТ-1.

Штамм выделен из лугово-болотной почвы Орджоникидзевского района Ташкентской области.

Растет при температуре 28-56°С (оптимальная температура - 40-50°С) и рН среды 5,2-5,5. На среде при рН ниже 5,0 гриб не растет, а при 8,0 - растет, но протеолитическая активность культуральной жидкости постепенно снижается.

На твердой среде Чапека с кукурузным экстрактом (2%) и крахмалом (3%) мицелий гриба бесцветный, ветвистый, септированный, диаметром 2-5 мк. Спороносные гифы мицелия распадаются на споры. Споры в цепочках шаровидные, гладкие, просвечивающиеся, темно-коричневого цвета. Диаметр их 8-12 мк. Встречаются споры овальной формы размером 7,0-9,0X10-12 мк. Колонии через 2 суток с белым воздушным мицелием, затем чернеют и через 5-7 суток становятся агатово-черными.

Среда Чапека с пептоном (1%). В двухсуточной культуре колонии белые, пушистые, кольцевидные, на третьи-четвертые сутки от кольца диаметром 2-3 см мицелий «разбросан в виде тяжей по всей поверхности питательной среды в чашке Петри. На пятые-седьмые сутки колония становится черной.

Среда Чапека с пептоном (1%) и крахмалом (3%) - (сахароза исключена). Через

двое-трое суток колонии бесцветные, кожистые, выпуклые, вросшие в агар. На пятые- седьмые сутки колонии становятся черными. Края колоний неровные, поверхность бугристо-,морщинистая, бархатистая.

Сусло-агар. Через сутки начинается почернение мицелия, и Б семисуточной культуре мицелий становится агатово-черным, бархатистым. На жидких вышеуказанных средах гриб образует на поверхности черную пленку и рыхлый мицелий в толше среды. На пшеничных отрубях растет медленно. Через 8-10 суток отруби становятся черными. В качестве источника азота гриб использует органический азот в виде пептона, кукурузного экстракта, дрожжевого автолизата, желатина, казеина, гемоглобина, яичного альбумина. Наилучший рост гриба и биосинтез его протеолитичёских ферментов наблюдается на

среде с кукурузным экстрактом, слабее на среде с пептоном или дрожжевым автолизатом и еще слабее на других источниках азота. Очень слабо растет на средах с минеральным азотом. В качестве источника азота использует глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, маннит, глицерин, декстрин, инозит, крахмал. Слабо растет на среде с арабиновой, раффиновой, рамнозой, дульцитом и сорбитом.

Предмет изобретения

1. Способ получения протеолитичёских ферментов путем культивирования их продуцен5JOB на питательной среде, содержащей источпики углерода и азота, с последующим выделеиием ферментов из среды, отличающийс я тем, что, с целью получения термостабильных ферментов, в качестве продуцентов ис-5 пользуют грибы Torula thermophila. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, 6 что из грибов Torula thermophila используют штамм УзПТ-1. 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что щтамм Torula thermophila УзПТ-1 культивируют на водной питательной среде, содержащей 20% спиртовой зерновой баоды к 1,5-2% крахмала.