Штамм актиномицета 243-11 Советский патент 1977 года по МПК C12N1/14 C12G1/02 C12G1/02 C12R1/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков, и может быть использовано при стабилизации полусладких вин. Известен фзнгицидный антибиотик 243, относящийся к грунпе органолентических гептаенов-леворипа, кандицидина, трихомицина, аскозина, используемых в медицине, виноделин и других отраслях промышленности 1. При использовании данного антибиотика в виноделии сернистый ангидрид и холод не применяются. Однако данный штамм не обладает достаточной продуктивностью. Цель изобретения - получение фунгицидного антибиотика, обладающего высокой продуктивностью, а именно антибиотическая активность культуральной жидкости у щтамма 243-11 составляет 8230 ед. в 1 мл, а у штамма 243-6130 ед. в 1 мл. Предложенный штамм получен мутацией из исходного штамма следующим образом. Исходный штамм актиномицета № 243 вида Actinomyces levoris культивируют в жидкой питательной среде следующего состаГороховый экстракт Пептон MgSO4-71120 Ре8О4-7П2О0,001 Дистиллированная вода1,0 л рН6,8 Перед засевом актиномицета в указанную жидкую питательную среду вносят раствор химического мутагена NaN02 в количестве 3,0% объема среды, разливают в пробирки по 5 мл и вносят в них споровую суспензию актиномицета № 243 в количестве 0,5 млн. спор на 1 мл среды. Инкубацию проводят при 27°С в течение 14 суток (I генерация). Полученную культуру актиномицета рассевают на поверхность агаризованной питательной среды того же состава в чашки Петри с тем расчетом, чтобы получить отдельные колонии актиномицета. Посев культуры инкубируют нри 27°С в течение 14 суток (II генерация). Полученные отдельные колонии актиномицета сгруппировывают по морфологическим признакам, из каждой группы высеивают по 100 колоний на косяках в пробирках. Посев культуры инкубируют при 27°С в течение 10 суток. Таким путем получено всего 396 штаммов актиномицета (III генерация). Полученные штаммы актиномицета изучены по фунгицидной активности в отношении тест культуры Torula utilis. Для этого агаризованную питательную среду того же состава разливают в стандартные чашки Петри по

10 мл, расставленные по горизонтальной поверхности. Каждый исследуемый штамм засеивают на трех чашках. На поверхность ага- ризованной среды петлей наносят штрихи спор, взятые с косяка, и шпателем равномерно распределяют по всей поверхности. Инкубацию проводят в течение 5 суток при 27°С. Из полученных газонов актиномипета вырезают блоки диаметром 6 мм и накладывают в трех повторностях на поверхность агаризованной среды № 44, предварительно инокулированной глубинным способом тест культурой Torula utilis, из расчета 100 млн. клеток на 1 мл среды. Чтобы обеспечить одинаковую толшину слоя среды, инокулированную питательную среду № 44 разливают в стандартные чашки Петри, расставленные по горизонтальной поверхности, по 10 мл в каждой.

Состав среды N° 44 следуюший, %:

Пептон1,0

Дрожжевой экстракт3,0

iNaCl0,5

NasPOi0,3

Глюкоза1,0

,0

Агар1,5 Водопроводная вода

до 1 л, рН 6,2

Инкубацию тест культуры Torula utilis проводят при 37°С в течение одних суток. По полученным зонам задержки роста тест-культуры судят о фунгицидной активности штамма, а по величине диаметров и плош,ади зон - о продуктивности данного штамма актиномицета.

Из изученных 396 штаммов актиномицета фунгицидную активность выявили только 40 штаммов, т. е. 10%. Остальные 90% оказались инертными.

Из выявленных 40 активных штаммов актиномицета ЛЬ 243 для дальнейшего исследования отобраны 12 штаммов, имеюшие активность больше, чем у исходного штамма. Их четыре генерации были изучены указанным методом по фунгицидной активности. В результате этого отобраны 4 штамма, имеющие превосходство в активности больше 20% ио сравнению с исходным штаммом. Такими были штаммы № 243/8, 243/11, 243/34 и 243/47.

Отмеченные перспективные 4 штамма изучены по способности продуцирования антибиотика № 243 Б условиях ферментации, для чего берут качалочную колбу емкостью 850 мл, помешают в нее 150 мл жидкой питательной среды и проводят ферментацию при 27°С в течение 5 суток, при этом процесс ферментации осушествляют в круговой качалке, делаюшей 229 об/мин. Состав ферментационной среды следуюший, %: Кукурузная мука 5,0 Соевая мука 1,0 по редуцируюш,им

вешествам

NaCl0,5

СаСОз1,0

Активность культуралЬной жидкости определяют сПектрофотометрическим методом. Берут 2 мл культуральной жидкости, добавляют 8,0 мл Диметилформамйда, встряхивают в течение 30 мин, отфильтровывают, разводят 80%-ным этанолом 1 : 20 и снимают оптическую плотность при длине волн 380 нм. Полученные данные оптической плотности вставляют в специальную формулу, разработанную Ленинградским институтом антибиотиков для определения активности полиенового антибиотика Леворина, и вычисляют активность культуральной жидкости

,44.D-103.a,

где А - активность исследуемого раствора; D - оптическая плотность раствора; а - кратность разведения.

Изучение указанных 4 штаммов актиномицета № 243 описанным методом проводилось в трех повторностях. Так изучали их три генерации, в результате чего отобран наиболее активный штамм актиномицета № 243/11, продуктивность которого, по сравнению с исходным штаммом N° 243, больше на 34%.

Далее проведено токсономическое изучение мутантного штамма N° 243/11 на основе обшепринятой методики. Для установления идентичности антибиотиков, продуцируемых исходным штаммом актиномицета Act. levoris № 243 и мутантным штаммом № 243/11, изучены их химическая природа и спектр фунгицидного действия. Установлено, что антибиотическое вешество, продуцируемое исходным штаммом Act. levoris № 243 и мутантным штаммом № 243/11, по своей химической ирироде и антибиотическому действию аналогичны.

Полученный штамм актиномицета Actinomyces levoris 243/11, продуцент антибиотика № 243, имеет следующую морфологическую и физиологическую характеристику.

Величина мицелия штамма № 243-II после инкубационного периода: длина 5-9 мк, толшина 0,09-0,11 мк.

На среде Чапека с крахмалом - рост хороший, мучнистый, колонии нлоские, гладкие, слегка кратерообразные. Воздушный мицелий розовато-лиловый. Субстратный мицелий бледно-терракотовый. Спороносцы прямые, извитые (волнистые), собранные в пачках. Споры овальные, круглые, гладкие.

Глицерино-аспарагиновая среда № 79 - рост хороший, колонии нлоские. Воздушный мицелий белый. Субстратный мицелий кремовый. Спороносцы прямые, споры овальные, гладкие.

Крахмало-аммиачная среда - рост хороший, колонии плоские, гладкие. Воздушный мицелий беловатый.

Сзбстратный мицелий кремовый. Спороносцы прямые, извитые, споры овальные, круглые.

Картофельный агар - рОСт хороший, мучнистый, колонии плоские. Воздушный мицеЛИЙ беловатый. Субстратный мицелий бистровый. Спороносцы прямые, споры овальные, гладкие.

Среда Треспера (H2S)-рост хороший, колопии гладкие. Воздушный мицелий кремовый. Субстратный мицелий рыл еватый. Спороносцы прямые, извитые. Споры овальные, круглые.

Отношение к углеродам. Усваивает глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит, мальтозу, галактозу, натрий уксуснокислый. Не усваивает сахарозу и сорбит. Слабо усваивает лактозу.

Желатин разжижает, молоко энергично пептонизирует, крахмал гидролизует, нитраты слабо восстанавливает. Не может расти на клетчатке.

При лабораторной проверке активности полученного мутантного штамма 243-11 в сравнении с исходным штаммом 243 оказалось, что антибиотическая активность культуральной жидкости у штамма 243-11 составляет 8230 единиц в 1 мл, а у штамма 243- 6130 ед в 1 мл.

Выход антибиотика № 243-11 из культуральной жидкости на 34-40% больше, чем у исходного штамма 243. Полученный штамм № 243-11 хранится в музее промышленных культур отдела антибиотиков в виде посева на косяках агаризованиой среды в пробирках.

Формула изобретения

Штамм актиномицета Actinomyces levoris 243-11, используемый для стабилизации полусладких вин. Хранится в коллекции НИИ садоводства, виноградарства и виноделия МСХ Грузинской ССР.

Морфологические признаки.

Величина мицелия после инкубационного периода: длина 5-9 мк, толщина 0,09- 0,11 мк.

На среде Чапека с крахмалом - колонии плоские, гладкие, слегка кратерообразные.

Воздушный мицелий розовато-лиловый.

Субстратный мицелий бледно-терракотовый Растворимого пигмента не образует и среды не окрашивает. Спороносцы прямые, волнистые, собрапные в пачках. Споры круглые, овальные, гладкие.

Физиологические признаки.

Органическая глицерино-аспарагиновая среда. Рост хороший, колонии плоские. Воздушный мицелий белый. Субстратный мицелий кремовый. Спороносцы прямые, споры овальные, гладкие.

Крахмало-аммиачная среда. Рост хороший, колонии плоские, гладкие. Воздушный мицелий беловатый. Субстратный мицелий кремовый. Спороносцы прямые, извитые, споры овальные, круглые. Картофельный агар. Рост хороший, мучнистый, колонии плоские. Воздушный мицелий беловатый. Спороносцы прямые, споры овальные, гладкие.

Среда Треснера. Рост хороший, колонии гладкие. Субстратный мицелий рыжеватый. Спороносцы прямые, извитые. Споры овальные, круглые.

Отношение к углеводам.

Усваивает глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит, мальтозу, галактозу, натрий уксуснокислый. Не усваивает сахарозу и сорбит.

Отношение к желатину, молоку, крахмалу и нитратам.

Желатин разжижает, молоко пептонизирует, крахмал гидролизует, нитраты слабо восстанавливает.

Антимикробные свойства.

Подавляет рост всех изученных видов естественной дрожжевой микрофлоры виноградного вина, не действует на бактерии.

Антибиотическая активность составляет 8230 единиц в 1 мл.

Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:

1. Журнал «Антибиотики № 1, январь, том XVII, издательство «.1едицина, М., 1972 г., с. 15-18 (прототип).