Изобретение относится к ферментной промышленности, а именно к способам получения а-1,6-глюкозидазы.
Известен способ получения а-1,6-глюкозидазы путем культивирования ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли.
Целью изобретения является повышение активности а-1,6-глюкозидазы.
Достигается это тем, что в качестве продуцентов используют бактерии, относяш,иеся к роду Lactobacillus.
Из рода Lactobacillus используют штаммы Lactobacillus gayonii АТСС 8289, Lactobacillus plantarunn АТСС 8008, Lactobacillus brevis IFO 3345, Lactobacillus brevis IFO 3960, Lactobacillus bulgaricus IFO 3533.
Известны ферменты, способные селективно гидролизовать а-1,6-глюкозидные связи в глюкозе и отличающиеся один от другого различной ферментативной активностью, благодаря чему их классифицируют на три типа: изомеразы, пуллуланазы и R-энзимы.
Полученные ферменты могут быть применены для утилизации крахмала и других аналогичных продуктов разложения, таких как гликогены, декстрины и пуллуланы. Обнаружено, что изоамилазы и R-энзимы, полученные из дрожжевых культур и растений, имеют
Таблица 1
Специфичность к субстратам
очень низкую активность и очень низкие оптимальные температуры (от 20 до 40°С), в то время как пуллуланазы, выделенные из бактериальных сред, имеют относительно высокую активность, причем эта активность в наибольшей степени проявляется при температуре, лишь немного превышаюшей 45С. Поэтому, чтобы найти ферменты, которые обладали бы специфичностью по отношению к различным субстратам и были пригодны для использования в тех случаях, когда необходима более высокая специфичность, а также ферменты, которые бы обладали улучшенной теплостойкостью и активностью, были предприняты исследования бактерий, производящих а-1,6глюкозидазы.
j ри этом учитывалось следующее явление; если какой-то шта.мм вырабатывает фер1мент, имеющий а-1,6-глюкозидазную активность, то при добавлении к нему раствора, содержащего крахмал и йодистый калий, раствор приобретает синюю окраску.
Было отобрано таким образом определенное количество щтаммов, относящихся к бактериям вида Lactobacillus. Эти щтаммы культивировались на культуральыых средах, предназначенных для аэробных молочнокислых бактерий. Для культивирования каждого щтамма брали 100 мл культуральной жидкости, температуру которой ноддерживали на уровне 30°С.
Энзиматическую активность определяли, используя супернатант {надосадочная жидкость), полученный в результате центрифугирования культуральной жидкости.
Каждую композицию, состоящую из 5 мл 1%-ного ожиженного клейкого рисового крахмала, 1 мл 0,5 М уксуснокислого буферного раствора и 1 мл раствора, содержащего испытуемый фермент, выдерживали при температуре 40°С в течение 30 мин.
Из реакционного раствора с момента начала реакции ферментолиза и до его завершения отбирали аликвотные пробы объемом 1 мл. Последнюю пробу отбирали спустя 30 мин после начала реакции. Каждую отобранпую из раствора пробу выливали в смесь 30 мл 0,01 я. раствора серной кислоты и 0,01 н. раствора подйодистого калия. С.месь становилась пурпурной, и спустя 15 мин определяли ее коэффициент экстинкции (т. е. поглощения) при длине волны видимого света 620 ммк. Величина прироста коэффициента экстинкции реакционного раствора, полученная в результате измерения в начале реакции ферментолиза (при «нулевом времени) и спустя 30 мин, рассматривалась в качестве критерия ферментативной активности.
В этих условиях абсолютное увеличение (прирост) коэффициента экстинкции на 0,01 соответствует единице энзиматической активности.
Из бактериальных штаммов, исследованных на активность по описанной выще методике, применялись штаммы, принадлежащие к видам, которые продуцируют больше ферментов во внешней среде, окружающей клетки, чем в самих клетках, в частности Lactobacillus plantarum. Эти штаммы культивировались в специальных банках и затем очищались для дальнейшего исследования ихэнзи(Матического поведения и специфичности по отношению к различным субстратам.
Степень размножения бактерий в культуральных средах определялась по изменению коэффициента экстинкции каждой культуральной жидкости, разбавленной в 10 раз, причем коэффициент экстинкции измерялся при длине волны 660 ммк. За изменением рН культуральной жидкости следили при помощи стеклянных электродов.
Аэробные штаммы вида Lactobacillus культивировались в специальных банках в условиях аэрации при 30°С в течение 3 дней. Штаммы подвергались очистке посредством автолиза культуральных сред, высаливания из раствора сульфатом аммония и двукратного диализа супернатанта.
Энзимы бактерий вида Lactobacillus имеют более высокую оптимальную температуру (50°С) и более высокую теплостойкость. Отсюда можно сделать вывод, что энзимы бактериальных культур вида Lactobacillus в большей степени приспособлены для иромыщленного использования. Оптимальная область рН для энзимов вида Lactobacillus равна 5,5, но они остаются активными и при относительно низких значениях рН.
Специфичность ферментов по отношению к различным субстратам оценивалась следующим образом: субстрат подвергали воздействию р-амилазы, являющейся одним из энзимов группы а-1,6-глюкозидазы, и затем определяли скорость энзиматического разложения субстрата. В качестве субстратов для этой цели использовали картофельный крахмал, рисовый крахмал, р-предельный декстрин, гликоген, декстран и пуллулан. Скорость разложения пуллулана оценивалась по скорости накопления в реакционной среде мальто-триозы, которая получается в результате ферментативного гидролиза пуллулана, а скорость разложения других субстратов оценивалась по тому, с какой скоростью в реакционной среде накапливалась мальтоза - продукт ферментативного гидролиза этих субстратов.
Указанные три типа ферментов обладают постоянной активностью по отношению к 1,6связям в крахмальных системах, но все эти три типа ферментов являются практически неактивными по отношению .к декстрану.
Ферменты бактериальных щтаммов вида Lactobacillus по своим энзиматическим свойствам относительно а-1,6-глюкозидов очень похожи на пуллуланазы вида Aerobacter.
Пример 1. Производство а-1,6-глюкозидаз бактериальными культурами.
В результате йод-крахмальной реакции находят щтаммы бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus.
Эти штаммы культивируют в колбах, а затем испытывают на энзиматическую активность.
10 мл культуральной среды, имеющей состав, указанный ниже, засевают с помощью небольшой платиновой ложечки испытуемым штаммом, после чего его культивируют 4 дня при температуре 30°С. Аэробные бактерии культивируют при перемешивании и вибрации питательной среды, в то время как молочнокислые бактерии культивируют в стационарных условиях.
Состав культуральной среды (%) для бактерий:аэробных молочнокислыхПептон 1,0001,000 Дрожжевой 0,5000,5005 экстракт 0,1000,100 К2НР04 0,0500,050 MgSO4-7H.00,0500.050 РеЗОд-ТНаО0,0010.001 Разжиженный крахмал1.4000,700 .Чальтоза-0,500 Данные, полученные в результате культирования, представлены в табл. 2 Таблица 2
Данные о энзиматической активности и специфичности изоамилазы по отношению к различным субстратам представлены в табл. 3.
Пример 2. Получение энзимов из Lactobacillus plantarum и изучение их свойств.
В этом примере используют культуральную среду того же состава, что и в примере 1.
Культивирование бактерий в каждом случае осуществляют в 1 л культуральной жидкости пои 30°С и перемешивании в течение 3 дней. Получены следующие результаты: прирост рН 0,95-4,0, активность внеклеточная 16. внутриклеточная 17, общая 33.
JacTBOp фермента штамма Lactobacillus plantarum получают насыщением супернатанта (надосадочной культуральной жидкости) сульфатом аммония до получения 0.8 насыщенного, раствора. Выпавший осадок отделяют .центрифугированием, растворяют в воде и диализуют против воды в течение одного дня.
Раствор Lactobacillus максимальную активность проявляет при значениях рН от 5 до 6.5. При определении оптимальной температ ры установлено, что раствор Lactobacillus не теряет.активности вплоть до температуры 55°С, что указывает на .высокую теплостойТаблица 3
кость этих ферментов по сравнению с другими.
При определении специфичности исследуемых ферментов по отношению к различным субстратам получают и подвергают очистке ряд субстратов, чистота которых устанавливается при помощи бумажной хроматографии. В число этих субстратов входят: крахмал картофельный и рисовый, р-предельный декстрин, декстран. гликоген и пул,1улан.
Эти субстраты подвергают одновременному воздействию какого-либо одного из испытуемых энзимов и |3-амилазы, причем полученные результаты выражают путем опенки скорости накопления в реакционной среде мальтоз или мальто-триоз. Ферменты бпктепияльных культур вида Lactobacillus не обладают способностью различать этот субстрат.
В табл. 4 приведены данные, показывающие процентное содержание в реакционной смеси низкомолекулярных сахаров-мальтозы (мальто-триозы), рассчитанное на общее содержание сахароз в реакционной смеси. Таблица 4 Реакционная смесь (мл); Субстрат (1%)50 Ацетатный буфер (0,5 М, рН 6,0)1 р-Амилаза (5 единиц)1 Цуллуланаза1. Общее содержание Сахаров оценивается при помощи антропного метода, а концентрация в реакционной смеси низких Сахаров оппеделяется по методу Сомоги - Нельсона. Образцы р-предельного декстрина, В-я.тттлазы, мальтозы, пуллулана и мальто-трпо.чы. к топые ИСПОЛЬЗУЮТ при пповеленнт испытаний, поллпают в лаборатории, я их чистота устаяяпливается при помощи бумажной хроматографии. Характеристики Lactobacillus Lactobacillus ffavonii АТСС 8289 CLactobacillus fermentum АТСС 8289) Палочки размером от 0.5 ло 1,0 мк, от 3,0 до 15,0 мк в паре или в цепочке. Неподвижны. Грамноложительны. Органическая среда. На следе, содепжатцей дрожжевой экстракт-глюкозу - желатин, разжижение желатина не наблюдается. Агар. Колонии плоские, кольцевые, небольщие. прозрачные. На КОСОМ агаре «наблюдается -незначительный рост. На жидкой среде. Бульон мутный, осветляется по истечении нескольких дней. Молоко не свертывает или свертывает слегка. Восстанавливает лакмус, метиленовый гплубой, индигокармин, тиосУЛьЛат натрия. Из восстанавливает HoS. Образует кислоту из глюкозы, фруктозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, маннозы. галактозы, раффинозы. Арабинозу, рамнозу, сорбит, маинит, инулит, декстрин, крахмал и силицин сбражизает. При брожении альдогексоз образует молочную КИСЛОТУ (оптически недеятельна), yKcvcную кислоту, этиловый спирт и двуокись тлерода. При брожении фруктозы образуется манппг: Нитраты в нитриты не восстанавливает. Микроаэрофильные. Температуры: оптимальная 41-42°С, минимальная 5--18°С, максимальная 48-50°С. Lactobacillus plantarum АТСС 8008 Палочки с закругленными краями размером 0,7-1,0 и 3,0-8,0 мк, отдельные или в виде коротких цепочек. Граммположитсльнь. При посеве уколом на желатин, дрожжевой экстракт, глюкоза: рост нитеглгдиый, разжижения не наблюдается. На косом агаре незначительный рост. На жидкой среде образует муть, осветляется по истечении нескольких дней. Лакмусовое молоко: кислое, коагулированное. Образует кислоту из глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы, арабинозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, раффинозы, салицина, и в меньшей степени, из сорбита, маннита. декстрина, глицерина и ксилозы. Рамнозу, крахмал и ИНУЛИН не сбраживает. ПРИ брожении гексозосахапов образует МОЛОЧНУЮ КИСЛОТУ (оптически недеятельна) только с небольшими количествами уксусной кислоты и двуокиси углерода. Из пентоз образует уксусные и молочные кислоты. НИТРИТЫ не восстанавливает в нитпаты в обычном бульоне. Микроаэрофильные. Трмпература развития 10-40°С, оптимальная 30°С. Солевыносливость: растет на среде, содержагней 5,5% соли. Lactobacillus breyfs IFO 3345 Lactobacillus breyis IFO 3960 Палочки размером 0,7-1,0 и 2.0-4.0 мк с закругленными краями, встречаются по одной и в виде коротких пеночек, ре.ггко в длинных нитях, которые МОГУТ иметь гранул. Нопотпоктты ГпаМмполпжительны. Желатин не разжижает. На косом агаре незначительный рост. На жидкой среле o6oa3veT MVTb. осветляется по истечении нескольких дней. Из молока образует кислоту. Не разрушает казеин. В качестве источника тлерола использует ляктат кяльния. Образует КИСЛОТУ из арабичозы. ксилозы, глюкозы, фруктозы, галактозы и мя.яьтозы. Сялинин. маннит, глицерин, рамнозу, декстпин, ИНУЛИН и крахмал редко сбраживает. При брожении альдогексоз образует мо.тгочную кислоту (оптически недеятельна). УКСУСНУЮ КИСЛОТУ, этиловый СПИРТ и ДВУОКИСЬ УГлепола. При брожении фруктозы образуется маннит.... Из цектоз восстанавливает уксусную и МОЛОЧНУЮ кт-слоту. Темггрпатура развития 15- ЗВС. оптимальная 30°С.
Lactobacillus bulgarkus IFO 3533
Тонкие палочки с закругленными концами в виде ценочек. Неподвижны. Граммположительны.
Желатин и молочную сыворотку не разжижает.
Колонии плоские, желтовато-белые, диаметром 2-3 мм. Агар и молочная сыворотка: колонии кольцевые, асимметричные.
Молоко коагулирует при температуре 37°С. Газа не образует. Казеин не разлагает. На картофеле не растет. Индола не образует. Сбраживает глюкозу, лактозу и галактозу.
Не сбраживает ксилозу, арабинозу, сорбозу, рамнозу, дульцит, маннит, декстрин, инулин и крахмал.
Сбраживает сахарозу и мальтозу. Образует высокую кислотность в молоке. Молочная кислота оптически недеятельна.
Нитраты не восстанавливает в нитриты. Микроаэрофильны. Оптимальная температура развития 45-50°С, минимальная - 22°С.
10 Предмет изобретения
Lactobacillus plantarum АТСС 8008.
Lactobacillus bulgaricus IFO 3533.
