Способ получения фермента -1,6 глюкозидазы Советский патент 1978 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА а-1,6-ГЛЮКОЗИДАЗЫ

Изобретение относится к вопросам биохимии, а именно к способам получения а-1,6-глюкозидазы и |3-амилазы одновременно. Известен способ получения а-1,6-глюкозидазы путем культивирования микроорганизмов, принадлежащих к роду Bacillus на питательной среде, в которой в качестве источников углерода и азота используют продукты неполного гидролиза крахмала или мальтозы и гидролизат железа или смесь их с солью аммония 11. При этом поддерживают температуру среды на уровне 30° С и рН 7,0-7,3. Известен также способ получения |3-амилазы с помощью шкроорганизмов, относящихся к разновидности Bacillus, например Bacillus poiymyха. Bacillus megaterium. Таким образом, известные способы получения ,6-глюкозидазы и -амилазы независимые, преду сматривающие использование не одной и той же культуры, а различных. Как известно, cs-1,6-глюкозидазу и Д-амилазу используют при производстве мальтозы из крахмала, которое ведут двумя стадиями: на первой стадии обеспечивают воздействие на крахмал первого фермента, а на второй - второго. Таким образом, для получения указанные знзимов культивируют соответствующие микроорганизмы по отдельности, а при осуществлении процесса получения мальтозы создают различные условия для осуществления последовательно двух производственных стадий. Все эти недостатки усложняют процесс. Целью изобретения является разработка способа, обеспечивающего получение одновременно с ферментом а-1,6-глюкозидаза фермента )3-амилаза. Для достижения указанной цели из рода Bacillus для культивирования на питательной среце, содержащей источники, углерода, азота и минеральные соли, при работе по прецлагаймому способу используют щтаммы Bacillus cereuc var. mycosi des (PERM N 2391) илиBad I us sp. УТ 1002 (FERM №2837) или Bacillus sp. УТ 1003 (PERM № 2838). Baci 11 us cereus была представлена Fermentation Research institute of Cluba-shi, JlSpan согласно . FERM № 2391 20 декабря 1973 г. Bacillus sp. УТ 1002 и Bacillus sp. УТ 1003 были представлены этим же институтом 12 декабря 1974 г согласно FERM N 2837 и FERM N 2838. Ниже представлена характеристика этих микроорганизмов. Bacillus cereus липоидная ра1зновидность (FERM № 2391), Палочка размером (1,1-1,4) х X (4,2-7,0) мкм, обычно находящемся в длинной или короткой цепи подобно :алесени или Actinomyces. Неподвижная, грам-положительная, сп ранпш без ощутимого разрастания. Штательный бульон. Хороший рост, осадо Питательный косой агар. Обильное прораста филаментный, распределен по поверхности, кре вато-белый. Гдюкозо-асп агиновый агар. Нет хорошего роста. Филаментный. Глюкозо-нитратный агар. Нет роста, а если есть - очень незначительный. Тиразиновый косой агар. Хороший рост, филаментный, слегка коричневый. Использование цитрата. Положительное. Молоко. Пептонизация. Картофель. Хороший рост, желтовато-белы слегка коричневый. Желатин. Разжижает. Получение аммиака. Положительное. Получение ацетилметшткарбшюла. Положи тельное. Восстановление нитрата до нитрита. Отриц тельное. Катапаза. Положительная. Получение индола. Отрицательное. Гидролиз крахмала. Положительный. Бульон с NaCI. В бульоне с 4% NaCI не р вивается. Bacillus sp. УТ 1002 (PERM № 2837). Палочка размером (1-12) х (5-6) мкм, н ; подвижная, грам-положительная, встречающаяся в виде короткой или длишГой цепи. Питательный бульон. Осадок. Питательный косой агар. Незначительный рост. Молоко. Медленная пепгонизация. Картофель. Хороший рост, распределяется по поверхности, желтовато-белый. йСслатин. Разжижение. Получение аммиака. Положительное. Восстановление нитрата в нитрит. Положи ное. Каталаза. Положительное. Ацетилметилкарбонил. Производится. Цитратнатрия. Незначительный рост. Органический источник азота. Необходим роста. Карбогидрат. Из глюкозы, фруктозы, гала тозы, маннозы, лактозы, сорбита, глицерина, тр галозы, крахмала и гликогена образуется кисл а не газ. Температура роста. Произрастает при темп туре не выше 50° С, оптимальная температура 3 35С. Эта культура вьщелена из почвьь Bacillus sp. УТ 1003 (PERM N 2838). Палочка размером (1-1,6) х (2-7) мкц, подвижная, грам-положительная, встречается в де короткой или длинной цепи. Питательный бульон. Хороший рост, обра Питательный косой агар. Хороший рост, распределяется по поверхности, желтовато-беяый. Глюкоза-аспарагиновый агар. Незначительный рост. Молоко. Пептонизация без коагуляции. Желатин. Медленное разжижение. Получение аммиака. Положительное. Ацетилметилкарбинол. Производится. Цитрат. Используется как источник углерода. Карбогидрат. Глюкоза, фруктоза, галактоза, манноза, а-арабиноза, D-ксилоза, лактоза, сукроза, мальтоза, трегалоза, раффиноза, маннит, сорбит, глицерин, инсулин используются без образования газа. Температура роста. Максимальная 45° С, оптимальная 30-33° С. Культура вьщелена из почвы. Предлагаемый способ заключается в следующем. Одну из указанных культур культивируют в среде,включающей источники углерода к азота. В качестве первых используют мальтозу, крахмал, гидролизаты последнего (декстрин), в качестве вторых - пептон, казеин, экстракты мяса, дрожжей, воду после замачивания зерна, сено, соевый жмых. Источьшки азота при необходимости пополняют неорганическими солями - фосфатом, солью магния, солью бария и солью кальция. В случае использования воды после замачивания зерна из нее предварительно удаляют вещество, ингибирующее образование /З-амилазы. Для увеличения выхода а-1,6-глюкозидазы и |3-амилазы добавляют в среду соли марганца или различные его соединения, например сульфат марганца. В первом случае соли марганца добавляют в среду в количестве порядка 1x10 -1х10 моля, во втором случае соединение марганца добавляет в среду в количестве порядка 1x10 моля. В среду добавляют цитрат и/или тартрат в количествах порядка 0,01-1%. При использовании цитрата или тартрата натрия их вносят в среду в количестве 0,1%. В среду добавляют также (для увеличения выхода ферментов рапсовое семя, рапсовый жмых, экстракт. Культивируют бактерии в условиях аэрации при 20-40° С в течение 24-72 час. При культивировании рН среды меняется от 5,5 до 9,5, оптимальное значение 6-8. Полученные энзимы имеют ячеистую структуру. Их регенерируют фильтрацией культуральной жидкости, затем фильтрат концентрируют путем добавления ацетона, этанола, метанола или изопропанола и образования осадка. Для осаждения применяют также сульфат аммония. Получают /3-амилазу и а-1,6-глюкозидазу в смеси в виде осадка, насыщенного сульфатом аммония. Для регенерации ферментом используют также такие адсорбенты, как крахмал, активировантов с помощью крахмала улучшается, если его предварительно нагреть до 40-65° С. Адсорбированную Э-амилазу элюируют раствором, содержащим 1-10% мапыоэы, или раствором, содержащим растворимый крахмал, декстрин мальтозу. Адсорбированные на активированном угле энзимы могут использоваться как связанные энзимы. Так, /3-амилаза адсорбируется в количестве 8000-12000 единиц, а а-1,6-глюкозидаза в количестве 500-1000 единиц на 1 г активированного уг ля. Адсорбированные энзимы сохраняют свою активность на уровне 90-100% от ее первоначального значения. Ферменты хорошо адсорбируются и на диатомовых веществах, например перлите, и сохраняют в таком состоянии активность на высоком уровне (50-70% от первоначального значения). Характеристики энзимов - /3-амилазы и а- 16-глюкозидазы, полученных описываемым спосо бом, приведены ниже. |3-Амилаза. Действие. Энзим производит мальтозу из крахмала, амилозы, амилопектина, гликогена, дек стрина и др. Специфичность в отнощешш воздействия субстрат. Степень гидролиза мальтозы в амилозу ближе к 100% и крахмала в мальтозу к 60%. Энзим не гидролизует а-1,6-глюкозидазную связь, ко торая содержится в амилопектине, гликогене, декстрине и т.п. рН реакции составляет 3-10, оптимальное значение около 7,0. Температура реакции до 65° С, оптимальная около . Дезактивация. Около 20% активности теряется через 10 мин пребывания при 55°С. При 70°С через 10 мин наступает полная дезактивация. рН-Устойчивость. Энзим неустойчив в кислой среде при рН ниже 5,0. Стабилен в интервале рН 6-10,0. Ингибнрование. Ингибируется п-хлормеркурбензоатом и ,в некоторой степени монойодацетатом Активность после ингибирования п- хлормеркурбензоатом восстанавливается путем добавления цистеина... +4 Сильно Ингибируется ионами Си . Нд Ад, а также ионом Fe , Способ очистки. Энзим фракционируют путем осаждения из культурального бульона в результате насыщения 30-50% сульфата аммония с последующей высокоэффективной очисткой на хроматографической колонке с использованием Sephadex G-100. Измерение активности энзима. Энзимный раствор вносят в 2 мл 0,1 И раствора фосфзтного буфера (рн 7,0), содержащего 2,0% растворимо крахмала, и доливают дистиллированную воду до общего obbcivra 4 мл. Смесь инкубируют при лпОг .. ti. UpnftT 1 ЦЯС с начала реакции производит 1 мг мальтозы, обозначают как 1 единица. От 1,6- Глюкозидаза. Действие. Этот энзим гидролизует а-1,6-гл1окозидазную смесь амилопектина, который уже был в некоторой степени гидролизован Э-амилазой. Специфичность по субстрату. Энзим производит мальтотриазу путем гидролиза Ь(-1,6-глюкозиддзной связи пуллулана. В случае реакции с амилопектшюм не наблюдается усиления йодной красящей способности. Энзим проявляет активность на амилопектине, предварительно гидролизованном в некоторой степени амилазой. Энзим не действует на изомальтозу. рН реакции в пределе 5-10, оптимальное значение около 6-6,5. Температура реакции около 50° С, оптимальная около 50° С. Дезактивация. Около 50% активности теряется после 10-минутной выдержки при 50° С. Полная дезактивация наступает через 10 мин пребьшания при 65°С. рН-Стабильность. Энзим устойчив при рН 6-9, нестабилен в кислой среде и относительно устойчив вщелочной. Ингибирование. Энзим в некоторой степени Ингибируется п-хпормеркурбензоатом и незначительно - монойодацетатом. Значительное isiHni6Hpyющее действие оказывают ионы Но и Ад, инги р- + бируется также ионом Fe Способ очистки. Энзим фракционируют из культуральной жидкости путем осаждения 60-70% сульфата аммония с последующей очисткой на хроматографической колонке с использованием Sephadex G-100. Измерение энзимной активности. Активность измеряют по реакции, при которой в качестве субстрата используют пуллулан. Энзим производит из пуллулана мальтотриозу. Дня этого некоторое количество энзима добавляют к 0,5 мл 0,1 М раствора фосфата буфера (рН 7,0), содержащего 1% пуллулана. Смесь доводят до общего объема порядка 0,1 мл дистиллированной водой. Затем ее инкубируют при 40° С в течение 60 мин. Количество энзима, которое производит 1 мг мальтотриозы, обозначают как 1 единица. Из препарата можно независимо выделить /3-амилазу и «-1,6-глюкозидазу. Для этого жидкость насьицают сульфатом аммония до концентрации 30-50%. Происходит осаждение j3-амилазы. Затем насыщаю жидкость сульфатом аммония до концентрации 60-70%. При этом осаждается второй знзим. Полученные энзимы очищают на колонке, заряженной Sephadex. Пример Ь В эрленмейеровскую колбу емкостью 200 мл помещают 50 мл среды, содержащей 1% пептона, 0,3 КгНГОА, 0.1 MgSb47H2O и 1 мальтозы. Стерилизуют обычным способом, в среду вносят микоиды разновидности Bacillus nerpiis fFERM № 239П и культивируют при 30°С

в течение двух дней. После культивирования из культурального бульона центрифугированием удаляют клетки. Затем всплывающий слой исследуют для определения количества полученных энзимов. В результате было получено 628 единиц /J-амилазы и 18 единиц о-1,6-гликозидазы, считая на 1 мл среды.

Культуральный бульон помещают в целлофановую трубку и диализируют по отношению к дистиллированной воде для того, чтобы удалить остаточный сахар.

Часть указанных диализированных знзимов (в которых содержалось 204 единицы j3-амилазы и 5,6 единиц а-1,6-глюкозкдазы) приводят во взаимодействие с картофельной амилазой, амилопектином картофельным крахмалом, гликогеном и декстрином, каждый из которых был взят в концентрации 4% при рН 7 и 40° С (обадай реакционный объем составлял 4,3 мл).

Через постоянные промежутки времени отбирают пробы реакционного раствора, каждую из которых, берут в постоянном количестве, и в них определяют количество редуцирующего сахара по методу Somogyi Nelson. Состав сахара в реакционной смеси определяют с помощью метода хроматографии на бумаге (4 ч. пиридина, 6 ч. бутанола и 3 ч. воды). В результате установлено, что образовавшийся сахар почти полностью представляет собой мальтозу (90-96%), в том случае когда амилоза, амш1опектин, картофельный крахмал использовались в качестве субстрата и в конечном реакционном растворе наблюдали очень небольшое количеств сахара, имеющего Rf, соответствующий мальтотриозе (4-8%), В результате испытания с помощью Hucostat (производимого Vorthington Biochemical Corporation U.S.A ) было установлено, что образование глюкозы происходит в чрезвычайно небольшом процентном количестве (менее 0,1%). Картофельная амилаза, амилопектин, декстрин и картофельный крахмал, испытанные таким образом, практически нацело гидролизуются в мальтозу через 8 час реакции. Гликоген также гидролизуется не менее 4eiyi на 90% в мальтозу через 23 час реакции.

Пример 2. В среду, имеющую такой жесостав, что использовался в примере 1, инокулируют Baci 11 us; sp. УТ 1002 (PERM N 2837) и подвергают культивированию со встряхиванием при 30° С. Через 48 час культивирования в культуральном бульоне определяли количество образовавщихся энзимов. Было получено 121 единица /3-амилазы и 10,5 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 мл бульона.

Пример 3. В среду того же, что и в примере .1, состава инокулируют Bacillus зр.УТЮО (PERM N 2838) и подвергают культивированию со встряхиванием при 30° С. Через 48 час культивирования в культуральном бульоне определили количество образовавшихся энзимов. В результате получено 152 ч, /З-амилазы и 5,3 ч. а-1,6-глюкозидазы

J Пример 4. В колбу емкостью 1 л помещают 250 мл среды, содержащей (%) 1 полипептона, 0,3 К2НР04, ОД Мд8047НгЪ и 1 декстрина, и подвергают ее стерилизации по обычной методике. Затем среду инокулируют микоидами разновидности Bacillus cereus и проводят культивирование ее встряхиванием при 30° С. Через 48 час культивации культуральный бульон центрифугируют для удаления клеток и полученный всплывший слой испытьшают на знзиматическую активность.

Было получено 420 единиц /S-амилазы и 7,8 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 мл бульона. В 200 мл (часть указанного культурального бульона) вносят ю 75% сульфата аммония и полученную в результате осажденную фракцию центрифугируют и растворяют в небольшом количестве воды, а полученный в результате раствор испытывают на энзиматическую активность. В результате получено 83000 единиц /З-амилазы и 952 единицы а-1,6-глюкозидазы.

П р и м е р 5. Часть раствора энзима, полученного в примере 1 и состоящего из 10000 еданиц /3-амилазы и 275 едашиц а-1,6-глюкозидазы, приводят во взаимодействие с 1 г амилопектина при концентрации 1% в присутствии СаСЦ Реакция протекает при 40° С, рН среды при этом поддерживают на уровне 7. Редуцирующий сахар в реакционной смеси определяют по методике Somogyi Nelson. Получено 972 мг мальтозы. Количество полученной глюкозы составило 3,7 мг. Путем бумажной хроматографии обнаружено пятно мальтозы и пятно, соответствующее очень небольшому количеству мальтотриозы.

П р и м е |j 6. ПРИГОТОВЛЯЮТ среду, содержащую (%) 1 полипептона, 1 декстрина, 0,3 К2НРО4 и 0,1 MgS047H2O, а также среду, полученную в результате добавления к указанной среде различных количеств (1x10 -1x10 моли) сульфата марганца, как показано в табл. 1. Эти среды помещают (каждую объемом 50 мл) в эрленмейеровскую колбу объемом 200 мл и стерилизуют по обычной методике. После этого среды инокулируют микоидами равновидности Bacillus cereus и подвергают культивированию в условиях аэрации при 30 С в течение 42 час.

После культивирования культуральный бупься центрифугируют и верхний слой подвергают испытанию на содержание образовавшихся 0-амилазы и а-1,6-глюкозидазы. Результаты представлены в табл. 1.

Как следует из табл. 1, добавление сульфата магния повьццает количество полученной а-1,6-глн козидазы приблизительно в 3 раза.

Пример 7. В эрленмейеровские колбы емкостью 200 мл помеп т 50 мл среды, содержащей (%) 1 полипептона, 0,3 К2НГО4 и 0,1 MgS0 хТНаО, и стерилизуют. Затем среду инокулируют микоидами разновидности BacHlus cereus и подotnnn n/ Tn rvT7n itrUJ L« mtu

30° С. На 24-м часу культавировашш, когда количество -амилазы составило 237 единиц на 1 мл среды, в среду стерильно добавляют сульфат марганца в количестве 1x10, считая на количество среды, и цродолжают культивацию.

На 42-м часу культивирование прекращают. Культуральный бульон центрифугируют для удаления из него клеток и полученный в результате всплывший слой испытывают на (З-амилазную и а-1,6-гл козидазную активности. Результаты зтого испытания представлены в табл. 2.

Соль марганца, добавленная в среду в середин культивирования, повышает количество полученной ,6-глюкозидазы приблизительно в 1,7 раза и благоприятствует образованию |3-амилазы. Когда культивирование осушествляют в среде, содержащей марганцевую соль с самого начала, количество полученной а-1,6-глюкозидазы повышается приблизительно в 2 раза по сравнению с количеством, которое может быть получено без добавления соли марганца, а количество полученной амилазы понижено, всего лишь 28,8 единиц на 1 мл.

Пример 8. Готовят среду, содержащую (%) 2 полипептона, 0,3 Кг НЮ,, 0,1 MgSO47HjO и CaCl2, а также среды, полученные в результате добавления к указанной среде цитрата натрия в количествах, соответствующих концентрации 0,5 и 1%, и среды, полученные в результате добавления тартрата натрия к указанной среде в количествах, отвечающих концентрации порядка 0,25 и 0,5%. В эрленмейеровские колбы емкостью 200 мл помещают среды (в количестве 50 мл) и стерилизуют по обычной методике. В среды ннокулируют микоиды разновидности Bacillus cereus и подвергают их культивированию при 30° С в течение 42 час.

Затем культивируют, жидкость из каждой колбы центрифугируют и полученный в результате всплывший слой подвергают пробе на определение |3-амилазной и а-1,6-глюкозидазной активности Полученные в результате данные представлены в табл. 3.

В том случае, когда культивирование осуществляют в среде, содержащей рапсовый жмых, количество полученной а-1,6-глюкозидазы приблизительно в 2,4 раза превышает то количество, которое получается в среде, не содержащей рапсового жмыха.

Культуральный бульон, полученный в результате культивации в среде, содержащей рапсовый жмых, центрифугируют для удаления клеток. 2 л полученного всплывшего слоя объединяют с 4 л холодного этанола. Полученный осадок отделяют фильтрацией, а затем сушат. В результате получен порошкообразный знзим, состоящий из 115800 единиц |3-амилазы и 4640 единиц а-1,б-глюкозидазы на 1 г, что указывает степень регенерации р-амилазы 75%, а степень регенерации а-1 6-глюкозидазы -Добавление солей органических кислот заметно повышает количества полученных -амилазы и а-1,6-глюкозидазы.

Пример 9. В два баночных феркюнтатора емкостью 10 л помещают среду, содержащую (%) 4 молочного казеина, 0,3 К2НЮ4 и 0,lMgSO4 7Н2О и 5-10 М CaClj, а также 0,5 растворимого крахмала, причем в каждый ферментатор загружают по 0,5 л. В один из двух ферментаторов добавляют рапсовый жмых в количестве, соответствующем 4%, считая на вес среды. Затем среды двух ферментаторов стерилизуют 30 мин при 12lC. После этого среды инокулируют микоидами разновидности Bacillus cereus (100 мл) и осуществляют культивирование в условиях аэрации при 30° С при подаче воздуха с объемной скоростью порядка 5 мин при перемешивании со скоростью порядка 250 об/мин. Через 24 час культивации культуральный бульон центрифугируют и полученный в результате всплывший слой подвергают испытанию на энзиматическую активность. Полученные ре- . зультаты представлены в табл. 4.

Нагревают до 60° С 30 мин. К полученному раствору добавляют 300 мл фильтрата культуры микоидов разновидности BaciHus cereus. Фильтрат имеет рН7, 1403 единицы /3-амилазы на 1 мл и 28,0 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 мл. Смесь перемешивают для адсорбирования двух энзимов.

Затем смесь отфильтровывают для регенерации энзимов и испытьшают ца активность. Полученные результаты представлены в табл. 5.

Затем смесь крахмала и целита, на котором бьши адсорбированы оба энзима, добавили к 109feному водному раствору декстрина, содержащему 10% хлористого натрия. Это делают, чтобы осуществить элюирование энзимов с адсорбентов. В результате /3-амилазу и а-1,6-глюкозидазу регенерировали с выходами 100 и 85% соответственно.

Пример 13. Фильтрат (каждый объемом 100 мл) культуры микоидов разновидности Bacillus cereus, содержащей 758 единиц амилазы и 37,1 единицы а-1,6-глюкозидазы на 1 мл, смешивают с 5 г каждого из следующих веществ: кислой глины, бентонита, талька, целита и перлита с целью адсорбщш а-1,6-глюкозидазы.

Адсорбированный знзим регенерируют фильтрацией или центрифугированием, тщательно промывают водой и затем определяют его активность Полученные результаты представлены в таблице БКак видно из приведенных данных, а-1,6-глюкозидаза удовлетворительно адсорбируется всеми адсорбентами, количество адсорбированного энзима 400-700 единиц на 1 г.

Пример 14. К 100 г (вес сухого вещества) сжиженного крахмала с декстрозным эквивалентом 1,5% добавляют 30000 единиц р- амилазы, 3000 единиць1а-1,6-глюкозидазы и 0,73 CaClj. Смесь разбавляют до общего объема

ттг пс1п1 -а son Ап uarrv nQwiT пг SO С И VPTawawnnвают рН в интервале 6-6,5. В этих условиях осуществляют реакцию. Через 100 час в реакционной смеси определяют состав сахара методом буДобавлено к концу 24-го часа культивирования.

-ХЧДобавлено в начале культивирования.

мажной хроматографии. Сахар содержал (%) 90,6 мальтозы, 7,1 мальтотриозы, 0,0 глюкозы и 2,3 других сахаридов.

Таблица 1

Активность фиксированного энзима (С)

Выход фиксированного энзима (С/А-Вх100).%

Таблица 3

Таблица 4

106,0

24700

6220

95300

Кислая глига

Бентонит

Тальк

Целит

Перлит

Формула изобрете ни я

Способ получения фермента а-1,6-глюкозидаэы путем культивирования микроорганизма рода Ваcillus на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отличающийся тем, что, .с целью получения одновременно с указанным ферментом фермента /3-амилазы, из микроорганизмов Bacillus испольТаблица 6

700

694

200

О

О

зуют штаммы: Bacillus cereus var. mycosides (PERM № 2391) или Bacidus sp. УТ 1002 (PERM N 2837) или Bacillus sp. УТ 1003 (PERM

№ 2838).

Источники иьформахщи, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент Великобритании № 1281093, кл. С 3 Н, 1972.