(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ а-1,6-ГЛЮКОЗИДАЗ
1
Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению ферментов с помощью микробного синтеза.
Известен способ получения а-1,6-глюкозидаз путем культивирования их продуцентов на водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли.
С целью повышения выхода (х-1,6-глюкозидаз предлагается в качестве продуцента использовать штамм Micrococcus lysodeicticus IFO 3333.
Сущность описываемого способа заключается в том, что штамм выращивают в питательной среде, содержащей растворимый крахмал, пептон, дрожжевой экстракт, соли фосфора, магния, натрия и железа, в условиях аэрации на качалке при 30°С.
Рост определяют по изменению коэффициента поглощения культуральной жидкости, разведенной 10 раз, при длине волны 660 ммк, рН измеряют потенциометрически.
Активность фермента определяют следующим образом: к реакционной смеси, содержащей 5 мл 1%-ного раствора растворимого рисового крахмала и 1 мл (0,5 моль) ацетатного буфера, добавляют 1 мл раствора, содержащего испытуемый фермент. Смесь выдерживают при 40°С в течение 30 мин.
Из этой смеси по ходу реакции отбирают пробы по I мл. Каждую отобранную пробу добавляют к 30 мл смеси, состоящей из 0,01 н. раствора серной кислоты и 0,01 н. раствора йод-йодистого калия. Смесь становится пурпурной и через 15 мин определяют коэффициент поглощения этого раствора при длине волны 620 ммк.
Величина прироста коэффициента поглощения раствора в процессе протекания ферментативной реакции (в начале реакции и через 30 мин) является показателем ферментативной активности. В этих условиях прирост коэффициента поглощения на 0,01 соответствует 1 единице ферментативной активности.
а-1,6-глюкозидазы, синтезируемые штаммом М. lysodeicticus IFO 3333, имеют следующие свойства.
Оптимум рН5,5-6,0
Температурный опти45°С
мум
5-8 (фермент рН - стабильность быстро инактивируется при рН 5)
Фермент быТермостабильностьстро инактивируется при 40-45°С. Специфичность к субстратам: Картофельный крахмал-|Рисовый крахмал+ Декстран- Пуллулан+ Гликоген- Примечание: -|наличиеаквивности отсутствие активности. Пример 1. Штамм М.ly.sodcicticus IFO 3333 выращивают на средеследующего состава, %: Пептон Дрожжевой экстракт К2НР04 MgSO4-7H20 FeS04-H2O Растворимый крахмал1,4 Выращивание осуществляют в колбах иа качалке при 30°С в течение 4 суток. Общая ферментативная активность, определяемая описанным выще способом, составляет 7,4 ед/мл, из них внеклеточная активность равна 6,6 ед/мл. П р и м е р. 2. Получение фермента из щ гамма М. lysodcMcticus IFO 3333 и изучение его свойств. Питательную среду, содержащую, %: Мальтоза1 Пептон0,5 Дрожжевой экстракт0,25 Мочевина. 0,2 Мясной экстракт0,2 К2НР040,1 КС10,05 MgSO4-7n2O0,05 засевают 2% посевной культуры испытуемого штамма. Выращивание осуществляют в специальной емкости, содержащей 20 л среды, при 30°С в условиях аэрации и при перемешивании среды мещалкой, делающей 200 об/мин. Начальный рП среды 7,0. Через 3 суток (после око 1ча11ия вырапшвания) рП равен и о Бактерии отделяют от среды центрифугированием, промывают один раз водой. 0,1%-ный раствор додецилсульфата натрия в растворе буфера рН 7 суспендируют в соотнощении, равном 1 : 10 по объему в культуральной жидкости, и проводят автолиз иа качалке при 30°С в течение 48 час. После центрифугирования в надосадочную жидкость добавляют сульфат аммония до 0,8 от насыщения. Из выпавшего в результате высаливания осадка соответствующим количеством воды экстрагируют фермент, после чего осадок диализуют. По окончанию культивирования внутриклеточная ферментативная активность составляет 39,2 ед/мл, внеклеточная- 12 ед/мл. После очистки раствор фермента подвергают исследованию с целью изучения его активности. Оптимальный рН, фермента равен 5,5, оптимальная температура -42°С. При температуре выще 50°С фермент быстро теряет активность. То же имеет место при рП среды ниже 5. Характеристика используел-юго щтамма Micrococcus lysodeicticus IFO 3333 следующая. Кокки диаметром 1,0-1,2 мк неподвижные. Грамположительные. На желатине колонии от желтовато-белого до желтого цвета с волнистыми краями. Столбик с желатиной не разжижает. На агаре колонии небольшие, желтоватые, с блеском. На жидкой среде - образуют желтоватый осадок. Лакмусовое молоко не коагулирует, реакция слабокислая. На картофельном агаре колонии с блеском, лимонно-желтого цвета. Индол не образует. Образует кислоту на глюкозе, сахарозе и маините. На лактозе кислоту не образует. Крахмал не гидролизует. Нитраты до нитритов не восстанавливает. В качестве источника азота использует NH4H2P04, аммоний виннокислый. Рост проявляется по истечении 6 недель в растворе по Кону. Сапрофит. Аэроб. Оптимальная температура 25°С. П р е .т м е т и з. о б р е т е и и я Способ получения а-1,6-глюкозидаз путем культивирования их продуцентов на входной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, отличающийся тем, что, с целью повыщения выхода а-1,6-глюкозидаз, в качестве продуцента используют штамм Micrococcus Ivsodeicticus IFO ЗЗЗЗ.
