Способ получения глюконовой кислоты Советский патент 1975 года по МПК C07C59/38 C12D1/00 

тервале между 4,5 и 7. Во многих опытах максимальная активность была обнаружена при значениях рН от 5 до 5,5. Значения рН, соответствующие максимальной активности, также зависят от природы фермента, например, от того, используют ли каталазу, полученную из плесневых грибков (предпочтительна), или используют каталазу, полученную из печени млекопитаюодих животных.

Значение рН поддерживают в желаемой области с помощью обычных химических методов регулирования, не оказывающих отрицательного влияния на активность ферментов. Хорошие результаты получены при добавлении щелочей, соединений щелочных металлов, например гидроокиси натрия, углекислого натрия, гидроокиси калия, пригодны также органические основания.

Особенно целесообразно поддерживать значение рН внутри благоприятной области на постоянном уровне, что можно осуществить, например, с помощью автоматического титрования с применением стеклянного электрода и рН-стата. В соответствии с измеренными значениями рН-электрода рН-стат открывает клапан, который контролирует подачу щелочи, например раствора гидроокиси натрия, в реакционный сосуд.

Способ осуществляют при температурах, при которых активность ферментов имеет технически приемлемую величину. Наиболее предпочтительно осуществлять способ при температурах 10-60°С. При более высоких температурах происходит заметное денатурирование ферментов, а при пониженных - замедление скорости превращения. Особенно благоприятна температура 25-50°С.

Согласно изобретению способ можно осуществлять периодически или непрерывно.

Периодический процесс особенно просто осуществлять следующим образом: в реакционный сосуд, в котором находится глюкозосодержащий водный раствор, вводят катализатор и оставляют его в растворе до тгх пор, пока не произойдет превращение. При этом целесообразно, перемешивать раствор, лучше всего продувать кислородом. После завершения реакции катализатор удаляют, например центрифугированием, декантацией. Впоследств.ии,катализатор без дополнительной обработки снова можно использовать, а обработанный раствор также самостоятельно можно применять.

Осуществление способа по циркуляционному принципу дает возможность особенно просто управлять процессом. Кроме того, при этом варианте можно отделять образующуюся, глюконовую кислоту и, следовательно, удалять ее из равновесной реакционной смеси, благодаря чему превращение протекает особенно быстро и количественно. Глюконовую кислоту можно отделять обычными методами, например связыванием с помощью анионообменников, переведением в трудно растворимую соль или прочие производные.

Соответствующий изобретению катализатор можно получить фиксированием на подходящем носителе глюкозооксидазы и каталазы, при обработке этого носителя водным раствором, содержащим смесь глюкозооксидазы и каталазы. При этом тип применяемого носителя не имеет особого значения, но важно, чтобы находящиеся в связанном состоянии с носителем глюкозооксидаза и каталаза, сообща находились в непосредственной близости. Наиболее предпочтительно, когда соотношение активностей глюкозооксидазы и каталазы 1 : 10 или более. Очень хорошие результаты получены нри соотношении активностей

до 1 :200. Однако и при значительно более высоких соотношениях активностей были получены отличные результаты. Особое преимущество высоких соотношений активностей, т. е. высокая активность связанной каталазы

в отношении к активности глюкозооксидазы, заключается в том, что значительно снижается расход кислорода. Это снижение расхода кислорода объясняется немедленным образованием кислорода из перекиси водорода.

Получение катализатора А

50 г обычного продажного препарата глюкозооксидазы (ГОД) со специфической активностью 220 и/мг растворяли в 1 мл 0,5 н.

буферного раствора с рН 8,0 (триэтаноламин - НС1); затем в токе азота при температуре 30°С полученный раствор смешивали с 0,25 мл 2,3-эпоксипропилового эфира акриловой кислоты и смесь перемешивали в течение

30 мин при указанной температуре. Непосредственно после этого смесь охлаждали до 10°С. Затем в 18 мл дистиллированной воды последовательно друг за другом растворяли 3,0 г акриламида, 0,1 г М,М-метиленбисакриламида

и 300 мг ферментативного препарата с активностью глюкозооксидазы 20 U/мг и активностью каталазы 260 U/мг и полученный раствор вводили в реакционный сосуд. После этого, добавляя 50 мг перекиси бензоила и

0,5 мг 5%-ного раствора Ы,М-диметиламинопропионитрила, инициировали реакцию полимеризации. После завершения реакции полимеризации (примерно 1 ч) смесь выдерживали примерно в течение 12-18 ч при 4°С.

Затем полученный полимерный материал продавливали через сито с величиной отверстий 4 мм, промывали и высушивали. Специфическая активность связанного с носителем фермента составляла: глюкозооксидаза 281 U/мг,

каталаза 185 U/мг.

Полученный препарат впоследствии обозначен как ГОД-каталаза А.

Получение катализатора В

1,5 г ферментативного препарата с ГОД-активностью 20 и/мг и активностью каталазы 260 и/мг, а также 50 мг каталазы со специфической активностью 39000 U/мг растворяли в 15 мл дистиллированной воды и 7,5 мл .1 М

буферного раствора с рН 8,0 (триэтаноламин - HCl). Затем в атмосфере азота при 30°С к приготовлен.ному раствору п)11бавляли 1,25 мл 2,3-эпоксипропилового эфира акриловой кислоты. После этого реакционную массу слегка перемешивали в течение 30 мин при указанной температуре, охлаждали до 10С и смешивали с 15 г акриламида и 0,75 мл NyN-метиленбисакриламида в 78 мл дистиллированной воды. Добавляя 3 мл 5%-ного раствора аммонийпероксидисульфата и 3 мл 5%-ного раствора диметиламинопропионитрила, инициировали реакцию по;1имер 1зации. Последующую обработку производили аналогично описанному для катализатора А.

Специфическая активность полученной ГОД-каталазы составляла; ГОД 95 О/г, каталаза 4200 U/r.

Полученный ГОД-каталаза-препарат впоследствии обозначен как ГОД-каталаза В.

Пример 1. Периодическое осуществление способа.

20 г (0,11 моль) фруктозы и 1,1 г (0,0055 моль) гидрата глюкозы растворяли в 200 мл воды. Приготовленный раствор помещали в термостатируемый реакционный сосуд, температуру в жотором поддерживали равной 35°С. В реакционном сосуде находился рН-электрод, который через рН-стат был связан с бюреткой, наполненной 0,2 н. раствором гидроокиси натрия. Значение рП поддерживалось постоянным и равным 5,5 благодаря тому, что при понижении значения рН в результате образующейся в процессе реакции глюконовой кислоты в реакционный сосуд автоматически подавалось соответствующее количество раствора гилдроокиси натрия. Кроме того, в реакционном сосуде имелась трубка для ввода кислорода с фриттой, с помощью которой подавался 1 л кислорода в 1 ч.

К раствору фруктозы и глюкозы прибавляли затем 250 мг связанной с носителем глюкозооксидазы со специфической активностью 300 и/г. Через 50 мин определяли содержание глюкозы в растворе. Спустя 100 мин 20% введенной глюкозы превращалось в глюконоВуЮ КИСЛОТу.

Описанный выще способ повторяли с тем отличием, что дополнительно примешивали к раствору 2 мг катал азы со специфической активностью 40000 и/иг. Через 100 мин степень превращения глюкозы составляла 30%, спустя 200 мин - 40%. При еще более продолжительном времени реакции глюкозооксидаза инактивировалась.

Описанный способ повторяли, однако вместо связанной с носителем глюкозооксидазы и растворимой каталазы к раствору примешивали описанный выше ГОД-каталаза-препарат А в количестве 250 мг. Через 100 мин степень превращения составляла 50%, спустя 200 мин - 70% от взятого количества глюкозы. Инактивирования фермента не происходило, и npir более продолжительном времени взаимодействия практически всю глюкозу можно превратить в глюконовую кислоту.

Описанный способ новторялп еще раз, используя указанный ГОД-каталаза-препарат В. Через 100 мин степень превращения составляла примерно 40%, спустя 200 мин 94% глюкозы превращалось в глюконовую кислоту. Через 220 мин превращалось более 99% глюкозы.

Описанные опыты показывают, что при осуществлении изобретения, несмотря на значительно более низкую ферментативную активность, достигаются более высокие степени превращения. Кроме того, не происходит заметного Инактивирования катализатора, в то время как в опытах для сравнения, проведенных без каталазы и с растворимой каталазой, несмотря на более высокую ферментативную активность, происходит быстрое необратимое

ппактивирование ферментов.

Пример 2. Превращение по непрерывному принципу.

1 г связанного с носителем ГОД-каталазапрепарата В суспендировали в дистиллированной воде и препарату давали возможность набухать. Непосредственно после этого препаратом заполняли колонку с внутренним диаметром 20 мм и длиной 5 см. Через эту колонку со скоростью 1,2 л/ч пропускали раствор 50 г фруктозы и 2,75 г гидрата глюкозы в 500 мл воды, которая нри температуре 25°С была освобождена от присутствия воздуха. После прохождения реакционного раствора значение рП снова доводили до 6,5, прибавляя 0,2 н. раствор гидроокиси натрия, пропускали кислород и затем раствор снова пропускали по циркулирующему принципу через колонку. За каждый проход 100-120 мг глюкозы превращалось в глюконовую кислоту.

Через 23 прохода превращалось более 99% глюкозы.

Пример 3. Повторяли способ, описанный в примере 2, однако ферментативную колонку последовательно подключали к анионообменной колонке (загружена ацетатом 1МАС А 27), а значение рП регулировали, добавляя раствор гидроокиси натрия. Выходящий из анионообменной колонки раствор содержал

лишь 0,086% глюконовой кислоты в расчете на содержание фруктозы.

Пример 4. Описываемый опыт показывает, что скорость превращения глюкозы зависит от соотношения глюкозы и ГОД-каталаза-катализатора в растворе.

Способ осуществляли аналогично периодическому способу, описанному в примере 1, причем раствор 20 г фруктозы н 1,1 г глюкозы смешивали прп температуре 40°С, при рП 5,5 и при пропускании воздуха с применяемым в соответствип с изобретением катализатором А. Результаты, полученные через 100 мин с различными количествами каталпзатора приведены ниже.

Степень превращения

Количество глюкозы через 100 мин, % катализатора

100

24 69 97 250 500

Предмет изобретения

1. Способ получения глюконовой кислоты посредством окисления кислородом глюкозы в водиом растворе при каталитическом действии энзимы глюкозооксидазы с последующим выделением целевого продукта известными приемами, отличающийся тем, что, с

целью упрощения процесса, в качестве катализатора применяют смесь глюкозооксидазы и каталазы, находящихся в непосредственной близости одна от другой в связанном с подходящим носителем состоянии.

2.Способ по 1, отличающийся тем, что в раствор, содержащий глюкозу, дополнительно подают кислород.

3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что рН реакционной смеси поддерживают в интервале от 3,5 до 8, преимущественно между 4,5 и 7, добавлением щелочи или удалением образующейся глюконовой кислоты.

4.Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что процесс ведут при 10-60°С, преимущественно 25-50°С.