Способ иммобилизации микробных клеток Советский патент 1978 года по МПК A61K38/43 

1

Изобретение относится к способу получения препаратов микробных клеток, иммобилизованных на нерастворимой подложке, которые и 8 связанном виде обладают присущей им в на гивном состояНИИ способностью катализировать неко торые химические превращения благодаря нгшичию внутриклеточных ферментов. Предлагаемые препараты могут найти применение в химической, фармацевтической и пищевой промышленности,

В литературе описаны способы получения препаратов иммобилизованных на носителях микробных клеток.

В частности, описан способ получеНИН адсорбированных на кожном коллагене клеток йтамма Streptonii ces рНЛеоctipomogfenes содержащих активную глюкозоиэомеразу и способ удержания в геле грибковых клеток, содержащих гидроксилирующий фермент, способный . катешизировать превращение, конечным продуктом которого является кортизол.

Однако, в литературе отсутствуют сведения о способе получения иммобилизованных микробных клеток, предотвращающем диссоциацию (вымывание) клеток из носителя при манипулировании с такими препаратами в реакторах. Диссоциация клеток сопровождается снижением активности реактора и загрязнением реакционного- потока. Для предотвращения такой диссоциации или сведения ее к минимуму приходится жестко ограничивать условия проведения реакций.

Предлагается способ получения стабильных препаратов иммобилизованных микробных клеток, в которых не происходит вымывание клеток- из носителя в процессе реакции, заключающийся в том, что иммобилизация микробных клеток происходит посредством создания ковалентных связей между клетками и водонерастворимой полимерной матрицей.

В предлагаемом способе нативные микробные клетки ковалентио связываются с водонерас эоримыми макрочастицами полимера, несущими реакционноспособные групры. На наружной поверхности клеточных мембран находится больое количес вр-,функциональных групп (таких kak аминогруппы, гидроксильные и сульфгидрйЯьные-.-.группы и др.) , способных .реагировать с реакционноспособН 1ми группами, содержащимися в полиере (например, эпоксидных, галоидкарбонильныэс или Гсшоидметилкарбонильных).

Образование ковалентных связей моет происходить либо перед, либо посе образования полимера. В первом случае микробные клетки контактируют с этиленненасыщениым мономером, содержащим реакционноспособные группы, а -uiтем мономер подвергают полимеризации или сополимеризации в присутствли мономера, образующего поперечные связи, и инициирующей системы. Во втором слу чае, микробные клетки подвергают непосредственному взаимодействию с макрочастицами полимера, содержащего реакционноспособные группы. Такими полимерами могут быть природные, а также синтетические органические полимеры i

Применяегше этиленненасыщенные мономеры имеют формулу

О

И.

где а-водород, метильная группа хлор г

О00

I/ tU

S-Ce,-(P V S-C8, -C-R,

или

О

«

-c-x-a-x)-Z/

где а, ггшоген, азйдная, 2,3-эпоксипропо сидная, 2,3-эпитиопропоксидная,

N - (2,3-эпоксипропил) аминная, N .-( И -диааонийхлорид)фенил аминная, акрилоилоксильная, низшая алкилоксикарбонклоксильная или бензолсульфонилоксильная группа;

X - кислород или .NR 3 , где и j водород или алкил

У - алкилен, Cj- Cgj

n - целее число, 1 или 2;

Z - галоидацетильная, 2-(4,б-дихлор)-5-триазинильная, -п -толуолсульфонилвная, М - (галоидметил)-бен-.; эоильная или цианильная группа;

Х - X, при условии, когда Z -толуолсульфонильная группа, то X кислород.

Предпочтительным для образования связей являются мономеры и полимеры, содержащие эпоксидные, галокарбонильные и галометилкарбонильнЫе группы. Особенно предпочтительными являются те полимеры, которые содержат реакционноспособные мономеры 2,3-эпоксипропилметакрилат (глицидилметакрилат), 2,3-эпитиопропилметакрилат, метакрилоил хлорид и бромадетилгидроксиэтилметакрилат.

В этом случае, когда мономеры и полимеры содержат нереакционноспособные функциональные группы, когда например, ifj- гидроксильная группа или водород в мономере формулы .1 , то эти функциональные группы могут быть переведены в.реакционноспособные заместители известными способами. Это требует использования полифункциональнаго, иизкомопекулярного реагента. Таким/образом, когда R представляет собой гицроксильную в формуле I , то карбоксильные группы мономера клк полимера могут быть активированы при помощи реак1ши с соответствую11Ц м раагентом, активирующим кар&оксильныЕЭ группы, Taiian как: карбодииьп д например, дициклогексилкарбодиимнд или

этилмopфoлинoкapбoдии iид; N -этил 5 -фенилизоксазолин-3-сульфонат (реактив Вудворда); кетенимияы, такие как пентаметилен1сетен циклогексилимин; простые ацетиленовые эфиры, iianpnMep,.

этоксиацетилен;гексагалоциклотрифосфатриази1 ы Ы -гндроксифтальимид или N -гидрокснсукцинимид и другие реактивы, используемые для образования пептидной связи. Когда в формуле I

Z - водород, то Г5 дроксилыи:11е группы мономера или полимера могут переведены в активированное состояние при поыощи стандартных методов, предусматривающих обработку соединением формулы Z - галлоид и, особенно бромацетилбромидом, цианогенбромидом и 2-амино-4 , б-дихлор-- , 3 , 5-трназином. Процесс И1 4мобилизации применяют к микробным клеткам, таким как бактерии, дрожжи, актиномицины и грибки.

Предпочтительными кл.етка{лк являются

такие клетки, в которых первичная ферментативная система представляет собой оксидоредуктазы, особенно такие, как оксидаза глюкозы, которая не требует

решения проблемы растворимости субстрата, гидролазы, такие каксС |Ь -амилазы и пептидазы, и особенно ацилаза пенициллина; лиазы, предпочтительно вызывающие разрыв углерод - кислородных связей, и особенно такие, как фенилаланинаммонийлиаза и аспарат аммонкйлиаза, которые вызывают расщепление по .связям углерод-азот; и изомеразы, такие как рацемазы, эпимеразы,

цис-транс-изомеразы, и особенно изомеразы глюкозы. Предпочтительными видами бактерий являются: Pseu(3omonc s, XqutVipmonas,Aceioboic,ter, Абcaeig-ene s,,rTi,Es,cberichioi, Act-obact ei-jEi-win ia,serr at ia, Proteus, M icrococcos.SoipeinQifLoictobaciteuSjBac-iteus.Uooapd-ia,StreptortT(ces,Cor-snebacterium . Предпочтительными грибковыми, и дрожжевыми культурами являются: Rhodotr4j a,Rhodo,pQfi(aiuw,5porofaoEomvces, NVucor, Fuso(p4urn,eniciE iutn , Aspargr-ieeus, G&omepetta,Rhizop Js, Soiccharomvce5,ConidioboEus,B ssocheain s,Cc3(ridicla,CViaetomium, TriuhoderrnajSeptop ja,copr.inus, HumucoEa. иТр ichosporon.

Предпочтительным актнномицетом является микрополиспора. Особенно предпочтительными штаммами являются: Ebcherich-ia 0061,Bacterium codaveruc,,Proteus rettg-er-i.-Rhoaotruea graci tVa .PeniCiCEIUHI chp-jsog-enum и A,perg--ieeu% nig-erОбразование ковалеитных связей кле ток и реакцнонноспособного полимера, или связей клеток с реакционноспособным мономером с последующей полимеризацией или сополкмеризацией, протег кает в водной среде. Температура реакции образования связей с полимером или мономером, или реакции полимеризации после образования связей с мономером, может меняться в широком диапазоне, но предпочтительный диапазон составляет от 5 до 50°С, и особенно предпочтительный от 10 до 30°С. Время, необходимое.для образования связей, будет зависеть от выбранной системы и температуры образования связей но обычно составляет от 0,5 до 35 час предпочтительное время образования связей с полимером составляет от 15 до 30 час, тогда как время образования связей с мономером - от 1 до Бчас Процесс полимеризации обычно протекает в пределах от 1 до б час. Весовое соотношение полимер-клетки (сухой вес может широко меняться, но предпочтительное отношение находится в пределах от 0,1 до 25, особенно от 0,5 до Когда клетки связаны с реакционноспособным мономером, начинается процесс последующей полимеризации, протекающий в водной среде в присутствии одного или более сомономера или без него и бифункционального мономера, приводящего к образованию поперечных связей, и инициирующей системы. Могут быть взяты любые из сомономеров или мономеров, обеспечивающих образование поперечных сЬязей, и инициирующих сис тем, используемые для проведения полимеризации такого типа и не приводящие к снижению ферментативной активности . Подходящими сомономерами являются, например, акриловые, Л -хлоракриловые, метакриловые кислоты и глицидиловые, алкильные сложные эфиры на основе низших алкилов , N,N1 - (дизамещенные)аминоалкильные сложные эфиры, амиды, замещенные низшим алкилом амиды, амиды с.метилольными заместителями, N -монозамещенные аминоалкиламиды, N, N -дизамещенные .аминоалкиламиды, стирол, бутадиен и изопрен. В качестве предпочтительных сомономеров можно назвать стирол, акриловую кислоту, 2-гидрокси-З-().- (4-метил-пиперазинил )-пропилД.метакрилат и, особенно, метилметакрилат. Может быть использован целый ряд мономеров, образующих поперечный связи и придающих конечному полимеру характер пространственной сетки и водонерастворимость, например, акриловые мономеры или олефиновые соединения и другие мономеры, известные в этой области. Примерами таких мономеров являются 1-3-бутилен. диакрилат, этиленгликоль диметакрилат, 1,3-5утилен диметакрилат, 1,6-гексамётилендиакрилат, этилендиакрилат, диэтиленгликоль диметакрилат, N, N -метиленбисакриламид, неопентилгликоль диметакрилат, 1,1,1-триметилолэтан триметакрилат и дивинилбензол. Предпочтительным мономером, образующим поперечные связи, является N, N -метиленбисакриламид. Реакции полимеризации и сополиме-ризации инициируются свободными радикалами .Пригоднньчи инициирующими свободнорадикальцце процессы системами являются такие системы, которые гене- рируют свободные радикалы и обеспечивают протекание реакций полимеризации и сополимеризации с соответствующей скоростью в мягких условиях, что обусловлено термической чувствительностью клеточных ферментов. По этой причине предпочтительными являются окислительно-восстановительные инициирующие системы. Примерами таких систем являются перекисные соединения, такие как персульфаты аммония, натрия или калия, перекись бензоила и ди(втор.бутил)-пероксидикарбонат в сочетании с восстановительным агентом, таким как тиосульфат натрия, метабисульфат натрия, гексагидрат ферроаммоний сульфата, диметиламинопропионитрил или рибофлавин. Предпочтительной инициирующей системой является система диметиламинопропионитрилперсульфат аммония. Состав полимера может меняться в широких пределах, но предпочтительный состав, определяемый молярным процентным содержанием всего мономера, составляет от 15 до 90% реакционноспособного по отношению к клетке мономера, от О до 60% сомономера и от 10 до 40% мономера, образующего поперечные связи. Эти пропорции являются предпочтительными, независимо от того, .связываются ли клетки с мономером или полученным предварительно полимером. В некоторых случаях клетки обрабатываются полифункциональным сшивающим реагентом-для понижения потерь фермента из клеток. Предполагают, что один класс полифункциональных реагентов приводит к образованию поперечных связей на клеточной поверхности посредством взаимодействия с аминогруппами клеточной мембраны, в результате чего существенно понижается пористость мембраны другой класс обеспечивает такой результат за счет активации карбоксильных групп, присутствующих в мембране, которые затем взаимодействуют с аминогруппами мембраны и обазуют, амидные связи. Типичными приepa viH первого класса соединений явяются такие реагенты, как альдегид ировиноградной кислоты, глиоксаль, гидроксиадипальдегид, хлоран гидрид иануровой кислоты, тетраазотированный о-дианизидин, бис-диазатированный бен зидин, 1,3-дифтор 4,6-динитробензол, толуол 2,4-днизоцианат и, особенно, глута)альдегид, тогда как во второй класс входят такие соединения, как этилхлорформиат и водорастворимые кар бодиимиды, например, 1-этил-З-(з-диметиламинопропил) -карбодиимид Обработку клеток проводят перед присоединением к реакционноспособном мономеру или полимеру. Такую обработ ку проводят в водной среде. Эффектив ную обработку клеток можно проводить в широком температурном диапазоне, н предпочтительным диапазоном является интервал от 5 до , и особенно от 10 до . В зазисимЪсти от температуры и природы используемого аген та такая обработка требует обычно от 0,5 до 10 час, предпочтительно, когда она протекает в течение 2-4 час. Количество используемого реагента может существенно изменяться, обычно оно колеблется от 1 до 50 вес.% клеток {сухой вес, предпочтительно - от 5 до 25 вес.%. Предлагаемый процесс иммобйпизации микробных клеток вoдoнepacтвopи 1ым полимером, протекающий с образованием химических ковалентных связей, с дополнительной обработкой, необходимой для минимизации потерь клетками фермента, приводит к получению стабильной системы им14Обилизованного фермента, не требующей вь eлeния требуемого фермента. Вследствие устойчивости сие темы TI легкости фильтрации полученный продукт можно эффективно испольяова ь в водных каталитических химических процессах, проводящихся либо периодически с повторным использованием смеси, либо непрерывно. Применяемые в способе в качестве исходных веществ соединения могут быт получены известными способами. Продук ты ферментативных превращений выделяют известными методами. П р и м ер 1. К 80 г глицидилметакрилата и 1 л воды добавляют при перемешивании 30 rN, N -метиленбисакрил амиДа. После перемешивания смеси в течение 15 мин при комнатной температуре добавляют 10 г метилметакрилата, сйесь охла:«дают до 5°С и в течение 15 мин через охлажденную смесь пропускали азот. Затем добавляют 20 м диметиламинопропионитрила и 2 г персульфата . Смесь, находящуюся под атмосферой азота, перемешивают при до начала процесса полимеризации, затем дополнительно час при температуре окружающей среды, и выстаивают в течение 2 час. К образовавшемуся осадку добавляют 750 мп воды, и смесь интенсивно перемешивают, чтобы собрать полимер. Осадок отфильт ровывают, пpoгv ывaют водой и суиат на воздухе, в результате получают 120 г полимерного материала, белого цвета. Ферментативную культуру /MR CuEture/ft 2454 выращенную в аэробных условиях при и рН 5,8-7,0 на глюкозе, отфильтровывают, а клетки промывают водой и получают полусухую пасту. Клетки (250г/ 55 г сухого веса) поместили в раствор, содержащий 22 г 25%-ногб водного глутаральдегида в 1000 мл воды, рН суспензии довели до 6,2 и перемешивают в течение 1-3/4 час при комнатной температуре. Осадок отфильтрювывают и промывают водой, в результате чего получают 104 г сырых обработанных клеток, . обладающих 76% активностью от начальной активности оксидазы глюкозы. Суспензию 32 г сырых обработанных клеток и 16 г глицидилметакрилатного полимера в 240 мл воды перемешивают в течение 30 час при комнатной температуре, а затем отфильтровывают. Осадок промывают водой, получают 126 г сырых иммобилизованных клеток, обладающих 58% активностью оксидазы глюкозы исходных необработанных клеток. Пример2. К суспензии 600 мл сырых обработанных клеток A.n-iger полученных как и в примере 1 (активность оксидазы глюкозы 23 единицы/100 мг), в 20 .МЛ ацетонитрила добавляют одновременно 600 мг метакрилоил хлорида и 400 мг триэтиламина. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 час, затем помещают в 20 мл воды (конечное значение рН 6,03). К водной смеси в атмосфере азота, добавляют 1,3 г N,N -метиленбисакриламида, 750 мг метилметакрилата и 300мг акриловой кислоты. рН смеси доводят до 6,7 и обрабатывают 0,5 мл диметиламинопропионитрила и 250 мл персульфата аммония. Через 2 час от начала реакции смесь дополнительно обработали 150 мг персульфата аммония и перемешивают в течение часа. К реакционной смеси добавляют равный объем воды, смесь отцентрифугируют. Осадок отфильтровывают и промывают водой, получают 32,25 г сырых иммобилизованных клеток, обладающих 78% активностьюоксидазы глюкозы нативных клеток. Примерз. 47,3 г сырых иммобилизованных клеток из примера 1 помещают в 100 мл водного раствора, содержащего 10 г глюкозы, смесь перемешивают 21 час при комнатной температуре с аэрацией. В конце реакции статочная активность фермента 75% от исходной, а конверсия глюкозы до смеси глюконовой кислоты и сУ -глюконолактона составляет 99%. Процрсс окисления можно проводить, используя 30 г сырых иммобилизованных клеток примера 2 в 20 мл водного раствора, содержащего 2 г глюкозы, при этом достигают сравнимые степени конверсии субстрата и инактивации фермента, П р и м е р 4, Бульонную ферментативную культуру Troteus (АТСС 9250,Pii2.er Coet FD ) 18470-76-60, выращенную в аэробных условиях при и рн 6,8-7,0 на молочном казеине центрифугируют, клетки смешивают с водой, получают полусухую пасту. К суспензии сырых клеток (7,5 г сухого веса) в 100 мл воды добавляют 4 г 25% ного водного глутаральдегида. Смесь ,0 перемешивали в течение 3 час, а затем центрифугируют. Обработанные клетки повторно суспендируют в 100 мл воды, а затем при перемешивании добавили 7,5 г глицидилметакрилатного полимера полученного в примере 1, Смесь с рН а 7,0 перемешивают при комнатной температуре в течение 30 час. Осадок отфильтровывают, промывают водой и хранят в виде влажной массы до исполь зования. Иммобилизованные клетки содержат 65% активности нативныхклеток что оценивалось по скорости конверсии пенициллина ( в 6-аминопеницилиновую кислоту. Пример5. к суспензии 20 г (5,0 г сухого веса) иммобилизованных клеток Proteus ге ttgre примера 4 в 500 мл воды при рН 8,0 и температуре З7с добавляют 5 г калиевой соли ленициллина, рН суспензии поддерживаю на уровне 8,0 при помо1ди дозированног введения 1 н. No ОН , реакция гидролиза заканчивалась по истечении 3 час. Иммобилизованные клетки отфильтровывали, промывали водой и хранили вплот до их дальнейшего использования в вид сырой лепешки, рН фильтрата доводят д 2 при помощи 2 н. нее , экстрагируют этилацетатом, рН полученного водного слоя доводят до 4,3 при помощи 2 н. NaOH , упаривают и охлаждают, в результате чего получают белое кристаллическое вещество. Кристаллы отфильтровывают, промывают водой и высушиваю на воздухе, в результате чего получаю 2,17 г (выход 75%) чистой 6-аминопени ци; иновой кислоты. Иммобилизованные клетки характеризуются 50% активность ацилазы пенициллина исходных иммобилизованных клеток через .20 циклов. Примерб. К перемешиваемой смеси, находящейся под атмосферой азо та, 3,6 г бромацетилгидроксиэтилметакрилата в 15 мл воды добавляют 375 м N, N -метиленбисакриламида. Смесь охлаждают до 5с и обрабатывают 0,25 мл диметиламинопропионитрила и 38 г персульфата аммония. Смесь медленно перемешивали при комнатной температуре до начала реакции полимеризации. Затем мешалку останавливают, реакцион ную смесь выстаивают при комнатной те перг-туре в течение 2 час. Образовав1шуюся суспензию разбавляют 25 мл вода и фильтруют. Осадок промывают водой и сушат на воздухе в результате чего получают 3,7 макрочастиц полимера. Сырые клетки Proteus выращенные и выделенные как и в примере 4 (10 г, 2 г сухого веса) поместили в раствор , содержащий 0,8 г 25%-ногр водного глутаральдегида в 50 мл воды, рН суспензии доводят до 7,0 перемешивают 3 час при комнатной температуре и центрифугируют. Обработанные клетки смешивают с 50 мл воды до получения консистенции полусухой пасты. Суспензию 10 г обработанных клеток и 20 г бромацетилгидроксиэтилметакрилатного полимера в 120 мл воды перемешивают 30 час при комнатной температуре и рН 7,0. Смесь, отфильтровывают, и осадок промывают водой, получают 36,8 г сырых иммобилизованных клеток, характеризующихся 75% активностью ацилазы пенициллина исходных необработанных клеток. Пример7. К суспензии 46 г сырых и 1мобилйз6ванных клеток примера 6 в 500 мл воды, рН 8,0 при температуре 37-с добавляют 5 г калиевой соли пенициллина Q, рН суспензии 8,0 при помощи дозированного введения 1H.Nc3|OH . Иммобилизованные клетки отфильтровывают, промывают водой и хранят до их использования в виде сырого куска. рН фильтрата доводят до 2при помощи 2 н. НС и экстрагируют зтилацетатом. Полученный водный слой доводят до рН 4,3 при помощи 2 н NaOH, упаривают и охлаждают, получают кристаллическую 6-аминопенициллиновую кислоту. Примере. Суспензию 25 г сырых обработанных клеток А. n1gft из примера 1, и 2 г глицидилметакрилата в 60 мл воды перемешивают при температуре 7С в течение 17 час. Затем эту суспензиюдобавляют к смеси 2;2г N,N -метиленбисакриламида, 2 мл стирола, 450 мл метилметакрилата, 0,5 мл диметиламинопропионитрила и 1,5 г {2-гидрокси-З- 1-(4-мет илпиперазинил)-пропил -метакрилата в 40 мл воды при рН 6,8. Смесь в атмосфере азота, обрабатывают 200 мг персульфата аммония и перемешивают 3 час при комнатной температуре. Осадок; отфильтровывают и промывают водой, в результате чего получают 43,6 г сырых иммобилизованных клеток, характеризуницихся 75%-ной активностью оксйдазы глю Vкозы исходных необработанных клеток. ПримерЭ. 28,3 г сырых иммобилизованных клеток из примера 8 помещают в 200 мл водного раствора, содержащего 20 г глюкозы, и смесь перемешивают в течение 21 чар при комнатной температуре с аэрацией. Выход смеси глюконовой кислоты и а -глюконолактона 80-%. Реакционную суспензию отфильтровывают, осадок промывают водой, .получают 28 г сырых иммобилизованных клеток, характеризующихся 82%ной .активностью от исходной активности фермента. При и ер 10. Суспензию 5 г сыры клеток Proteuc, rettgreri , выращенных и вьщелениых как и в примере 4 и 10 г глицидилметакрилатного полимера примера 1 и 65 мл воды перемешивают 24 час при комнатной температуре Смесь о.тфильтровывают, и фильтрат про мывают водой, в результате чего получают 26,9 г сирых иммобилизованных клеток, характеризующихся 62%-ной активностью от начальной активности ацелазы пенициллина. 25 г иммобилизованных клеток (1 г сухих клеток) помещают в раствор, содержащий 0,4 г 25%-ного водного глутаральдегида в 50 мл воды. рН суспензии довел:; до 7,0 и суспензию перемешивают 3 час.при комнатной температуре. Суспензию отфильтровывают, и осадок промывают водой, в результате чег получают 23,2 г сырых о.бработанн.ых иммобилизованных клеток, характеризующихся 79%-ной активностью ацилазы пенициллина от активности необработанных иммобилизованных клеток, П р и м е р 11. Ксуспензии 12 г сырых обработанных иммобилизованных клеток, полученных в примере 10, в 100 кл воды при рН 8,0 и температуре 37°С добавляют: 1 г калиевой соли п нициллина (3. рН реакционной смеси под держивают 8,0 добавлением 1 н. NaOH Материал иммобилизованных клеток филь руют, промывают водой и хранят в виде сырого куска вплоть до дальнейшего использования. рН фильтрата доводится до 2 2 н. НСВ , фильтрат экстрагируется этилацетатом. Образующийся водный слой доводят до рН 4,3 при помощи 2 H.NaOH , упаривают и охлаждают в. результате чего получают кристаллическую 6-АПК. Пример 12. рН суспензии клето A-nigrer , выращенных и вьщеленных ка и в примере 1 (20 I, 4 г сухого веса) и 8 г гЛицидилметакрилата в 100 мл во ды доводят до 7,5 и суспензию встряхивают при комнатной температуре 18ча Добавляют 1,5 г N, N -метиленбисакриламид и полученную суспензию в атмосфере азота перемешивают 15 мин, за тем охлаждают до , обрабатывают 150 мг персульфата аммония и 1 мл диметиламикопропионитрила, перемешивают при температуре окружающей среды Зчас Продукт реакции отфильтровывают и про мывают водой,- получают 71 г сырых иммобилизованных клеток, характеризую.щейся 62%-ной активностью от началь1ной активности оксидазы глюкозы. 18 г иммобилизованных клеток (1 : сухого веса) помещают в раствор, содержащий 0,4 г 25%-ного водного глутаральдегида в 100 мл воды. рН суспензии доводят до 7,0 и суспензию перемешивают в течение 3 час при комнатной температуре. Осадок отфильтровывают и промывают водой, получают 17,3г сырых обработанных иммобилизованных клеток, содержащих 75% активности оксидазы глюкозы, присутствующей в иммобилизованных клетках перед обработкой глутаральдегидом. Пример 13. L4r сырых обработанных иммобилизованных клеток, полученных .в примере 12, помещают в 15 мл водного раствора, содержащего 1,5 г глюкозы, и смесь в условиях аэрации перемешивают 21 час при комнатной температуре, в результате чего достигают конверсии в глюконовую кислоту. П р и м е р 14. Клетки RhodotoruEq g-raciCis ( NRR с. 4 1 091 , Pf izer CuCt. F2(652l) выделили из бульонной культуры, выращенной в аэробных условиях при 28С и рН- 6,8-7,0 на глюкозе путем центрифугирования. 50 г промытых клеток в 250 мл воды обрабатывают 5 г глицидилметакрилатного полимера полученного в примере 1. Смесь перемешивают при комнатной температуре 20 час. Суспензию отфильтровывают, осадок промываюг водой, получают бЗг сырых иммобилизованных клеток, содержащих 49%- исходной- фенилаланин аммоний - лиазной активности. Пример 15. Суспензия 14,74 г сырых иммобилизованных клеток, полученных в примере 14,в 30 мл воды, 2,25 г. транс-коричной кислоты, 652 г хлористого аммония и 3,3 мл концентрированной гидроокиси аммония, рН суспензии 9,5. Смесь встряхивают 18час при 37°С, получают Ь -фенилаланина, Быход 90% в расчете на свободную коричную кислоту. Продукты реакции отфильтровывают и промывают водой, в результате чего получают 14 г сырых иммобилизованных клеток, содержащих 77% исходной фенилаланин--аммоний лиазной активности. L -фенилаланин выделяют из фильтрата стандартными методами. П р и м е р 16. Суспензия 40 г промытых клеток Rh.odotoroEa grac-itib , выращенных и выделенных как описано в примере 14, 8 г глицидилметакрилата в 80 мл воды, рН суспензии доводят до 7,2, смесь перемешивают при комнатной температуре 1,5 час. Добавляют 1,5 г N|N -метиленбисакриламида, перемешивают в атмосфере азота. 10 мин, затем охлаждают до 5 °С, обрабатывают 150 мл. персульфата аммония 1 мл диметиламинопропионитрила, перемешивают при комнатной температуре три часа.Суспензию разбавляют водой и отфильтровывают. Полимерный осадок промывают водой и получают 62,3 г сырых иммобилизованны клеток, содержащих 44% исходной фе нилаланин аммоний - лиаэной активност П р и м е р 17, Суспензию 15 г сы-рых и 4мoбилизoвaнныx клеток полученных в примере 16 и 30 мл воды, 1,12 г транс-коричной кислоты, 320 мг хлористого аг иония и 1,6 мл концентрированной гидроокиси аь1мония, рН суспензии 9,5. Смесь встряхивают при 37 18 час, получают U -фенилаланин, выход которого сравним с выходом L -фенилаланина в примере 15. П р и м е Р 18. Суспензию 15 г сырых клеток Proteus rettgeM выращенных и выделенных как описано в при мере 4, и 30 г глицидилметакрилатного полимера полученного в примере 1 вводят в 100 мл .воды, перемешивают при комнатной температуре 18 час, рН 7. Затем суспензию центрифугируют, осадок npoivtbJBatOT водой, в результате чего получают 100 г сырых иммобилизованных клеток, содержащих 100% ацилазы пенициллина исходной активности. К суспензии 25 г сырых иммобилизованных клеток в 70 мл воды при рН 8,0 и З7с добавляют 1 г калиевой соли пенициллина Q, Реакция гидролиза, про текает 3 час при рН 8,0 введением 1н,; NaOH. .Суспензию отфильтровывают, мобилизованные клетки промывают водой И -хранят в виде сырого куска вплоть до дальнейшего использования. Однако эффективность этих клеток с точки эре ния получения 6-аминопенициллиновой кислоты была- ниже, чем в примере 4, так как активность ацилазы пенициллина составила только 15% активности ис ходных клеток уже через 2 цикла. П р и м е р 19, к 25 г 2-гидроксиэтилметакрилата в 100 мл воды добав ляют 12,5 г бромистого дициана, растворенного в 100 мл воды. рН смеси немедленно доводят до 11 при помощи 5 и fJaOH в результате чего температура поднялась до 4.5°С, реакцию поддерживали при ЭТОМ, -значении рН до окончания реакции.. - Затем смесь охлаждают до комнатной температуры, доводят рН до 6,5 и обрабатывают суспензией 50 г высушенных замораживанием клеток Proteus ett f i, предварительно выращенных и выделенных как и в примере 4 в 500 мл воды. Образовавшуюся суспензию перемешивают в течение 45 мин. За тем добавляют 25 г акриламида и 2,5 г N, N -метиленбисакриламида, и суспензию перемешивают 15 мин, охлаждают до 4°С и обрабатывают 4 мл диметиламинопропионитрила и 425 мг персульфата аммония. Смеси дают нагреться до комнатной температуры и вызреть в течение часа. Затем смесь-гомогенизируют, используя смеситель Уоринга, и центрифугируют. Гелеподобный центрифугах суспендируют в воде, снова центрифугируют, промывают водой и высушивают замораживанием, получают 112 г сухих иммобилизоваиньзх клеток, содержащих 19% ацилазы пенициллина начальной активности. П р и м е р 20. К суспензии 20 г сырых клеток Ppoteus rettgepi, выращенных и выделенных как. описано в примере 4, в 80 мл воды добавляют 1 г 25%-ного водного глутаральдегида и 10 г глицидилметакрилата. рН суспензии доводят до 6,8, и суспензию перемешивают при комнатной TehmepaType .2 час. Затем смесь в .атмосфере азота обрабатывают 1,9 г N, N -метиленбисакриламида и 2 мл диметилазчинопропионитрила, рН доводят до 7 и обрабатывают 20 мг персульфата аммония. Образовавшуюся суспензию перемешивают 1/2 час, а затем дают ей вызреть при комнатной телшературе в течение .11/2 час. Осадок отфильтровывают и промывают водой, получают 81,3 г сырых иммобилизованных клеток/ содержащих .54% исходной активности ацилазы пенициллина необработанных клеток. Сырые иммобилизованные клетки используют для превращения калиевой соли пенициллина-Сг в 6-аминопенициллиновую .кислоту, как описано в примере 7. П р и м е D 21. Bacterium cadaverus САТСС 9760, PHzet Cueture.FD 24016) бульонная культура, выращенная в аэробных условиях при. 28 С и рН 6-8 на субстрате из гидролизо-;вакного протеина, центрифугируют, и клетки смешивают с водой для получения полусухой пасты. К суспензии сырых клеток (7,5 г сухого веса) в 1QO мл воды добавляют 4 г 25%-ного .водного глутаральдегида. Смесь пер .м 1ивают в течение 2 час при рН 7, атем цейтрифугируют. Обработанные клетки вновь суспендируют в 100 мл воды, при перемешивании добавляют 7,5 г.глицидилметакрилатного полимера полученного в примере 1. Смесь перемешивают при рН 7 и комнатной температуре в течение 30 час. Осадок фильтруют, промывают водой и до дальнейшего использования хранят в виде сырого куска. П р и м е р 22. 120 г фумаровой i кислоты добавляют к 140 мл концентрированной гидроокиси аммония. рН смеси доводят до 8,5 при помощи гидроокиси аммония, и объем реакционной смеси доводят до 600 мл. Добавляют иммобилизованные клетки, полученные в примере 21, содержащие 7000 единиц активности аспартат аммоний - лиазы, и смесь перемешивают при 4 час. Суспензию отфильтровывают, рН фильтрата доводят до 2,8 при помощи серной кислоты, в результате выпадает аспара4 гиновая кислота. Формула изобретения 1.Способ иммобилизации микробных Клеток, ют.л и чающийся тем что, с целью обеспечеиия стабильности Ьистемы и предотвращения потери активности микробные клетки подвергают взаимодействию с полимером, содержащим реакционноспособные группы или с noJiHMepHsyeNKaM этиленненасыщенным мономером, содержащим реакционноспособные группы для образования ковалентных связей между микробными клетками и водонерастворимыми частицами полимерной матрицы. 2.Способ по П.1, отличающ и и с я тем, что применяют исходные соединения, содержащие заместител такие как эпоксидные группы, галоидкарбонильные группы и галоидметилкарбонильные группы. 3.Способ по П.1 или 2, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что применяют микробные клетки, содержащие один из ферментов, включая оксидазу глюкозы, ацилазу пенициллина, фенилаланин аммонийлиазу, аспартат аммонийлиазу. 4.Способ по пп.1-3, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что .микробные клетки подвергают обработке полифункциональным реагентом, образующим поперечные связи. 5.Способ по п.4, отличающийся тем, что обработку реагентом, образующим поперечные связи проводят до реакции образования ковалентных связей с полимером или мономером. 6.Способ по п.5, отличающ и и с я тем, что в качестве реагента для образования поперечных связей берут глутаровый альдегид. 7.Способ по п;6,.отличающ и и с я тем, что микробные клетки подвергают взаимодействию в водной среде с глутаровым альдегидом, затем в водной среде с глицидилметакрилатом для образования ковалентных связей и затем мономер полимеризуют в присутствии N, N -метилен-бисакриламида и диметиламинопропионитрил персульфата аммония. - . Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: l.BioiftctinoE. Bioeng r. 15, 565, 1973.