Способ производства биомассы Советский патент 1976 года по МПК C12C11/00 

I

Изобретение относится к микробиологической промышленности. j Известен способ производства биомассы

i путем выращивания микроорганизмов в куль- туральной жидкости, содержащей метан и вод :ную Среду с питательными солями, в состав которых входят ионы аммония и другие-не ОбхрДИМЫе для роста МИН«ЧР «л,)вмв г:олн,

I Известный способ не обеспечивает доста-

ТОЧНОЙ скорости роста микроорганизмов,

j использующих метан, и приводит к их вымы Ванию.I С целью интенсификации процесса, по

предложенному ; способу cKqpocTb вьфашивания микроорганизмов поддерживают в пределах, О,81-5,О г/л в 1 час, осуществляя j одновременно регулировку рН культурной j жидкости до 4,5-8,0 путем введения в нее : ионов аммония : для поддержания их коН

центрации от 2,0 до 1ОО мг/л.

Ионы аммония вводят в виде аммиака i или гидроокиси аммония.

: Процесс вырашйвания осуществляют при : температуре, преимушественно равной 4248°С и используют бактерии t/HethytococcUS capsuiatus.

Способ осуществляют следующим образом.

Для производства биомассы используют i/Hethi ttococct si COpSutcttuS путем выращива, ния их в культурапьной жидкости, содержащей метан и водную среду с питательными солями, в состав которых входят ионы аммония и другие необходимые для роста мине. ральные соли.

Процесс:, проводят при нормальном давлении, а также применяют и избыточное давление до 3,5 кг/см при температуре преимущественно 30-48°С.

В качестве азотного субстрата используют аммиак или гидроокись аммония, ограничивая рН водной питатель нойсреды, добавленной к культурапь й жидкости, и регулируя рН путем добавления ионов аммония, при этом рН добавляемой водной среды должно рация составляла не более 1ОО мг ионов i аммония на 1 л, или поддерживают концен-р; рацию ионов аммония в культуральной жид-. jKOCTH в пределах 2-10О мг/л. рН жидкости регулируют в пределах 4,5-8,0 добавлеиием гидроокиси щелочного металла, наприм едкого натра, или серной или фосфорной кислоты. Концентрацию ионов аммония в культуральной жидкости поддерживают не выше 8О мг/л (предпочтительно в пределах . мг/л). При содержании менее 2 мг/л рост ограничивается иэ-аа недоста ка аммонийного азота. Большая часть ионо йммокия, добавленная X водной среде, ноЯоШ1зувтся микроорганизмами немедленно. Оставшаяся часть ионов аммония регулируется в необходимый пределах Практически кониеитрацик ионов аммония в культуральной жидкости поддер ивают в пределах 1О-ЗО о. мг/л, рН питатель ной среды, добавляемой к культуральной ж кости, поддерживают не менее 7,5 и более Низким, чем .фН культуральной жидкое. Водную среду выбирают на основе среды применяемой при ферментации метана, в ко торой часть или весь ис очник азота отсутствует. Количество каждого питатвльног вещества регулируют так, чтобы микроорганизмы рости с желаемой скоростью. Ско рость выращивания микроорганизмов поддерживают в пределах О,81-5,О г/л в час Пример, Стадия А - получение культуры бактерий, использующих метан. 5ОО млвзвеси метансодержащей грязи стоячих луж добавляют через интервалы в 5 дней в 3 л фе{н ектер,( , содержащийводную среду следующего состава, мг/л} .16ОО -f a HPO i2928 КваО.-7Н„014 Ca(NO,), ZhSO 7R200,34 Мп SO ,30 WaMoO ,24 НлНО,.1180,0 о. Мд ,0 Среда также содержит до 100О мл умягяеннЫ воды} рН - 6,2, В,, ферментере поддерживают температуру 45°CJ скорость разбавления О,О84 11(ешйлка работа ет при 1ООО об/мин; рН поддерживают добавлением 0,5 н, едкого натрия. Газонуи месь, состоящую из (об, %): 33 метана, 64 воздуха, 3 углекислоты, подают в ферментер со скоростью 20 об,/об. в 1 час, ПопуляпИям . бактерий, использующих метан, дают расТи естественным образом при этих селективных условиях. Через 7 дней кле- очная плотность популяции бактерий достигает 1,О г (сухой вес) иа 1 л. Из этой популяции выделен одив штамм бактерий) использующих метан. Количественное отношение метаниспользующих бактерий к другим типам равно 9О:95%. 1Бактерией, использующей метан, является кокк, имеющий диаметр 1,1-1,4 мкм, сапсулообра ющий л способный использовать метан и метанол, но не глюкозу. На твердом субстратте, сделанном путем добавления 1,0 вес,% на i об. агара к./; фврментаиионяЬй средеГхжнсгшной вьше.псхше, 3 дневной инкубации при под атмосферой метан - . (5О;5О по объему), колонии имеют следующую морфологию: диметр - 1-2 мм, гладкие, кругль1е, белого цвета.а Эти характеристики согласуются с-характеристиками штамма «/HethuiococCLkS capSatotuS. Стадия Б - промежуточная для накопления клеточной плотности, необходимой для устойчивой работы. 3,О л культуральной среды, содержащей популяцию использующих метан бактерий, полученнзро согласно стадии А, используют для пуска непрерывно действующего фермевтера с рабочим объемом 3 л, в которь|й непрерывно подают водную среду соста, мг/л: ,0 12Н О277,5 NaNO 1193,8 о МЗ «5 О . 7Н.О160,О Са( NO,j)2-4H2090,0 Ферментацию продолжают до погучения клеточной плотности примерно 5,0 г/л (сухой вес). Затем среду заменяют на следующую, мг/л: Ферментер поддерживают при 45 С и сжорости разбавления 0,18 час и 15ОО об/мин мешалки. Скорость подачи гааа составляет 30 об/об в час. Газ востоит из 2О об. % метана и 8О об. % воздуха. После нескольких минут, когда рН регулируют 1н. NaOH, рН поддерживают 6,О добавлением 1н. Н . О. и 1 н. НаСШ с помршью автоматического титратора. Ферме тацию проводят в постоянных усл«жиях в течение не менее 7 дней, при этом ная жид.сость стабилизируется на 5,О г/л, Пример 2. 3л культуральной жид-, кости, содержащий популяцию бактерий, ислользующих метан, полученную в соответст йии с Бьщелением и клеточной плотностью тадий А и Б в примере 1 используют для пуска непрерывно действующего ферментера с рабозим объемом 3,О л, в который подают водную среду состава, мг/л: 335,9; 277,5 Умягчеш1вя вода до 1ООО мл, рН-- 3,1. Стадия В. Ферментер поодержифают при 45 С, скорость разбавлейия 0,18 час . и 15ОО об/мии мешалки. Газ, состогаоий вз 2О о6. метана в 80 об. % воздуха, подают со ско ххлъю ЗО об/об, в 1 час, рН поддерживают в,О добавлением 1,1н гидроокиси/ аммония. Ферментацию поводят при постоянных условиях 7 дней, при этом клеточная плоо ность составляет 4,5 г/л (сухой вес) и скорость роста - г/л в 1 час (сухой вес). Выход по метану, т. е. вес полученных клетрк составляет (сухой вес) на единицу мвфана, поданного в ферментер - О,66, .а , по кислорбду - О,21. При до&1влении к культураш.ной жидкост питательной среды с рН - 13,1, содержащей 2,3 мекв/л Н- бО., при скорости раэ л бавления 0,18 час , получакшаяся в одно фазе концентрации ионов была такой, что для поддержания рН 6,О при у стойчнвом iiei epuBHOM процессе количество ионов аммоюш, требуемой.в водной фазе каждый данный момент, изменялось от 5,0 до 50,О мг/л. При атом гидросжись аммония служит ка источник агюта. П р и м е р 3. Стадия Б. 5,0 л культуральной жидкости, содержащей популяцию бактерий, использующих метан, полученную в соответствии со стадией А примера 1, используют для пуска непрерывно действующего с перемешиванием ферментера с рабочим объемом 5,О л..

В ферментер подают непрерывно питательную среду состава, мг/л: 732,0; . 647,2; WaNO о 2785,5; Мд 5о 7Н,.О 373,Oj Са ( 210.0; CitSo . 5Н2 10.6; Fe-So . 33,8; Zfi50 7H2O. Mn O CoCi . . . 2Н„О (збн) , 0,8 МЛ/Л HNO,, {13н) 7,3 МЛ/л о Умягченная вода - до 100О мл рН -1,3.. Ферментер действует npiii 45°C, скоро.сти раэбавтения- 0,18 час в ЗООО б/мин мешалки. Ско1хх гь подачи газа 66 об/об, н Г, 1 час. Газ состоит из 18,2 об. % метана и 81,8 об. воздуха, устанавливают рН - 6,1 и попд жишюют иа.втом уровне добавлением н. Н или 1и. Из автоматинескс«х тнтратора. При ади уаюшшх кЛеточная плотность постепенио уввлачйваетсп о 14;-г (сухой вес) иа 1 л. стадии среду язывн тот ii среду следукяиего состава, мг/л:

5OO767

11 450,0;

1

0,4 МЛ/Л. Умягченная вода до lOOO мл рН - 2 Стадия В. рН поддерживают 6,1 доба нием 1,1 k, /ijH.OH иэ автоматическог тйтратора. ; В этих же условиях клеточная плотао стабилизируется на уровне 25 г/л (сухо вбс).. Ф ерментацию проводят в устойчивом режиме неменее 7 дней. Скорость продуцирования бактерий, поймерно, 2,5 г/л в 1 час Ссухой вес). Избыток ионов аммония определяют кеа рнметрическнм методом. Данные испытаний (шиае|( & ь табл / Т а б л и ц а Примере. Станияг-т ; 50О мл м тансодержащей грязи стоячих луж добавл ют через интервалы в 5 дней в аэрируем с перемешиванием фермеНтатор рабочим объемом 5 л и содержанием 5 л водной о среды состава, мг/л: 1600; 12Н20 2928,О; На N0 о 116О,0; М0 ..,0 80,0} Ке . 7Н20 СаГД/0 ),.4Н„0 3 2, 2

12

4.0;

0,34; Мп «So, . Умягченная вода до 1ООО мл рН -6,25. ,. i . Ферментатор поддерживают при , скорости разбавления 0,084 час и скороти мешалки - lOOO об./мий; рН поддержи- вают на уровне в,75 добавлением О,5 н. едкого натр4. Газовую смебь из 33 об. % метана, 64 об. % воздуха и 3 об. % углёкислрть|г ют со СКОРОСТЬЮ 20 об,/об«час. Популяция 15актврий, использующих метан, свободно размножается и через 7 дней достигает клеточной-плотности в 1,1О г/л (сухой вес). На этой популяции выделяют 4один штамм метаниспользующих бактерий, а другие типы бактерий Не способны к использованию метана, при этом отношение их равно 9О : 95%,;, Метаниспользуюшей бактерией были коки с диаметром 1,1-1,4 мкм, капе улообразуюшие и способные использовать и метанол, лоне глкжозу.На твердом субстрате, приготовлеинрм путем добавления 1,О вас. % агара к ферментационной среде поЬле 3-4 дневной инкубации при 45РС под атмосферой метин воздух, 1солонии имеют следующую морфологию} диаметр 1-2 мм, гладкие, круглые, белого цвета. Эти характеристики во вбех отношениях согласованы с характеристиками штамма « tetb tOCOCCuS ca/jsulftiuS. Стадия Б. 5,0 культуральной жидкости, одержащей популяцию метаниспользующих бактерий, полученную предыдущим способом,, используют для пуска непрерывно действую- щего фермента объемом 5,0 л.,| В ферментер подают водную среду состава, мг/л{ ,5, . ,5; Mo О.. 7Н О562,5; J -., , ,0; -2 (безводный)112,5; Fe S0.7H2042,7; (безводный)223; Си .,5j .,5; ..,5; - fc Ma ,7} CoCt 2 ,5; Вода до lOOO мл рН - 2.6. j Ферментер действует при 45°С, CKppoca )азбавпения 0,18 часг1 и скорости мешалки ЗООО об/мин. Газ, состоящий из 18,2 об, % метана и 81,8 об. % воздухй подают со скоростью (66 об/обл т.час. рН устанавливают 6,5 едким натром и пс держивают на этом уровне добавлением 1и Л/аОН автоматическим титратором. Азот добавляют в виде 1,1н гидроокэгси аммония, которую подаютьасосом с псж бтепенно увеличивающейся скоростью для на 1растания клеточной плотности до 14 г I, (сухой вес). i Избыток ионов v а имопия в . ку11ьтуральной жидкости определяют путем .отбора каждые 1О мин образца в 10 мл и Л|10атем калометрическим методом или амми |вым зондом в комбинации с рН-метром и {Поддерживают от 5 до 100 мг/л с ручным .регулированием скорости подачи насосом. Стадия В, При достижении клеточной ; плотности 13,4 г/л на стадии Б избыток ;Х ионов амКюния поддерживают S-lO мг/л -путем подачи гидроокиси аммония в ферментер. Ферментацию прово жг в устойчивых условиях 17 дней. Клеточная плотность составляет 13,5 г/л при скорости продуциро- вания клеток х 0,18 г/л в j. час (сух вес). Выход по метану 0,63, по кислороду 0,23. П р и м е р 6. Стадия Ь. 3,и л культуральной жидкости, содержащей популяцию метаниспользующихбактерий, полученную в 5007 соответствии со стадией А примера 1, используют для пуска непрерыЬно действующего ферментера с рабочим объемом 3,0 л. -;/В фёрмантер подают среду состава, мг/л: , 335,0; I 277.5; v. . Мд 16О,О; Ке §0. 7Н20 14,5; CaCl 2 Сц S ,O Мп SO . Н„О 0/75; v 0,32; CoCt 2 6Н2О 0,О23; 2 и 0(36 ОД 2 5 мл/л. Умягченная вода до 1000 мл рН - 2,6. Ферментер поддерживают при 45 С, корости разбавления 0,18 час- ,и скоости мешажи 150О об/мин, 1 Газ, состоящий из 20 об. % метана и Ю об. % воздуха, подают со скоростью 0 об,У об. час. . Стадия В, рН поддерживают при 6,6 до авлением 1н. ёдко1 о натра из автоматичекого титратора, 1,1 н раствора гидроокии аммония подают насосом со скоростью, ответствующей концентрации ионов аммония жйдкдсти, ко орую .определяют калориметическим М81ГОДОМ, как в стадии Б примеа ,5. ермейтацию проводят в течение 7 днеь. В этих условиях клеточная плотность оставляет 6 г/л, чтосоответстует скороти продуцирования бактериальных клеток в ,9 г/л в 1 час (сухой вес).

15

16

Таблица 4,

рН в культуральной жидкости поддерж вают добавлением едкся: о иатра. Пример. 5,0 л куаьтуральиой жидкости в соотвйтстЬии со стадией А, примера 1, содержащую популяцию, мета испольэуюших бактерий, используют для п скат Непрерывно действующего: фэрйеитера с рабочим объемом 5,0 л, ;В ферментер подают среду состава, мг/л: 4 «20 --езупьтаты исследовани й .приведены в табл.4 Умягченная вода до 1000 мЛ рН - 2,25. Ферментер поддерживают при 4-5 С, .., скорости разбавления t), 18 и cicb-рости мешалки ЗООр 9§i/JM Газ состава 18,2 об.% метана и 81,2 об. % воздухаи подают со скоростью 66 об,/об, в 1 час. .. . В ферментер насосом добавляют 1,1 н. раствор гидроокиси аммония и ск.ор(сть подачи регулируют в соответствии с концентр рацией ионов аммония по методике примера 5. рН поддерживают 6,2 добавлением 1н раствора NaOH автоматическим титрато ром. Стадия В. „, В этих условиях Ц1еточная плотность стабилизируется на уровне, примерно 14г/л {сухой вес). Ферментацию проводят 7 дней. Скорость продуцирования бактерий 2,5 г/л (сухой вес). Данные испытаний приведены в табл.5..

n

JL.. Л

Подача qieflbi 815 мл/час Формула изобретений,

Таблица 5.

ния в нее ионов аммония для поддержания их концентрации 2,0-1ОО мг/л.

I .

2, Способ по п. 1, о-т л и ч а ю щ и и с я тем, что ионы аммония вводят в виде аммиака или гидроокиси аммония.

4. Способ по пп; 1-3, отличаю щ и и с я тем, что процесс выращивания осуществляют при температуре преимущест |Венно равной 42-48 С,