Способ получения биомассы Советский патент 1977 года по МПК C12D13/06 

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

Наиболее близким к описьшаемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения биомассы, заключающийся в непрерьшном культивировании метанутилизирующих микроорганизмов в жидкой питательно среде, содержащей ассимилируемые источники азота и минеральные соли, в присутствии метановоздушной смеси. При этом связанный азот находится в жидкой питательной среде в виде аммонийных или нитратных солей l .

Недостатком известного способа является использование связанного азота в избыточном количестве, превышающем количество, необходимое для .потребления микроорганизмов, что токсично для микроорганизмов, утилизирующих азот и метан.

Цель изобретения - частичная замена связанного азота в форме аммонийных или нитратных солей молекулярным азотом атмосферы или полное исключение из среды связанного азота.

Для этого по предлагаемому спосо6S в качестве метанутилизирующих микрЬ.- организмов используюТ; микроорШййамйиз рода MetfiySococcus , обладающие способностью фиксировать атмосферный азот, в жидкой питательной среде, при этом количество связанного аэота в питательной среде регулируют TaKitM образом, чтобы его уровень в среде в процессе выращивания был меньше того количества, которое содержится вготовой биомассе.

Нз рода Methytocotcus используют вид capsuEalus

Биомассу по предлагаемс 1у способу получают путем непрерывного выращивания культуры микроорганизмов иа рода MethySococcus вида capstiEalua , утилизирующих метан и атмосферный аэот в жидкой питательной среде.

Питательная среда содержит мииеральные соли, источник связанного азота в форме .аммонийных или нитратгаах солей, кроме в неё подают мвтано-BOSду1 } УШ ;Е 1§Е :. .При ЭТОМ связаиный. asoT ,:быт%: йолн-остью исключен из сос зва-:ди гат дь1н6й среды или его колич ЬтвО;; с л«йо-составлять 95-99% от количества азота , содержащегося в гото.вой биомассе,

Метано-воздушная смесь содержит, об.%: метан 10-50 (предпочтительно 12- -25); KHcj;opo,n 10,,9 (1 редпо тительно 16-17); азот 40-72. Эта cf. может бить обогащена чи тым кислородо.. В качестве источника метана может бъпь Ht;rioJib;jOBaH , природ ный га э . Культивирова 1Иб микроорганизман п водят при пов1.1шеипог давлени:1, напри мер, при 3-4 атм. рН питательной сре ды поддерживают 4,5--8,0, предпочтительно 5,5-7,0, для чего используют лечь, например, едкий натр. Температура среды в проиессе выра 1дивап 1Я находится в пределах от 20 д 60°С, преимущественно от 35 до 50°с. Оптимальные условия выращивания обес печиваются пои рН 6,5 и TBMnepaTvpe . Удельные скорости разбавления сос тавляют от 0,1 до 0,35 при выходе .биомассы от 0,1 до 10 г/л. Согласно изобретению биомасса мо.жет быть получена в две стадии. В первой стадии (стадия подготовки культуры) выращивают; микроорганизмы, утилизирующие молекулярный азот и метан, в жидкой пиха тельной среде, содержащей минеральные соли, /в присутствии источника связанного азота, аммонийных или нитратных солей метана в качестве источника углерода и газа содержащего свободный кислород. При этом концентрация клеток микроорганиз мов соста1зляет от 1 до 30 г/л. На второй стадии приготовленную культуру непрерывно выращивают в жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли, источник связанного азота, в присутствии метана и газа, содержащего свободный кислород и молекулярный азот. Количество связанного азота должно быть меньше того количества, которое, содержится в готовой биомассе. Связанный азот может быть вообще исключен из состава питательной среды. В стадии подготовки выращивание микррорх-анизмов можно осу ществлять как периодически, так и непрерывно. При непрерывной работе удельная скорость разбавления должна быть значительно меньше, чем максимальная уде ная скорость роста Микроорганизмов, а концентрация связанного азота - несколько больше трёбующейся длЯ обеспечения потребления .мй сроорга.низмами - oт 2.,ч6 ,,lQ;0::M.3J/Ji ;; : Исходной. культурой , для ;йнокулирования в стадии подготовки может быть культура микроорганизма, утилизирующего азот и метан, например культура на коссяч срезе агара. Ферментатор можно также инокулировать пробами веществ, содержащих микроорганизмы, например почвы или грязи. Если в качестве инокулятора исполь зуют пробы вещества, содержащего микроорганизмы, то подготовку культуры ведут в две стадии, на первой из которы: из вещества выделяют микроорганизмы, утилизирующие молекулярный азот и метан, а на второй - увеличивают концентрацию клеток указанных микроорганизмов до концентрации, необходимой в продукционной стадии. Лучший источник азота в этой стадии нитрат или ам1миак. Пробы вещества, содержащего микроорганизмы, можно добавлять в непрерывно действующую обогатительную систему. Предпочтительным является обогащение Е. непрерыннодайствующем ферментатора,, -содержащем любую вышеописанную- жидкую;, пйтаэ ельную среду с источником азот а-й Виде нитратных солей, при условиях, .ющйх размножению утилизирувдих молекулярный азот и метан микроорганизмов.. -. Скорость разбавления должна быть значительно ниже ожидаемой максимальной скорости роста микроорганизмов. Оптимальная рабочая температ-ура более 40°С, скорость разбавления 0,0-5-0,15 чЧ Пример. Т. Стадия подготовки культуры. 500 мл шлама, содержащего метан грязи из отстойника, добавляют с интервалами в течение 5 дней в аэрируемый ферментатор с 5 л жидкой питательной среды следующего состава, мг/л: KHjPO 1600 NajHPO -12H2O2928 МаЫОз1180 MgSOi,-7HjO80 FeSOj -THjO14 CaCWOj a-jHjO25 CuSOi,- SHjO4 ZfiSO tTHjO0,34 MnSOij-HaO0,30 NdjM OiiZHzO0,24 Дистиллированной водой доводят объем до 1л. Температура 45°С, скорость разбавления 0,084 ч, скорость мешалки ферментатора 1000 об/мин, рН 6,75 создают добавлением 0,5 н. раствора едкого натра. В ферментатор подают со скоростью 20 об/ч газовую смесь, состоящую из 33 об.% метана, 64 об.% воздуха и 3 об.% двуокиси углерода. Через 7 дней работы при указанных условиях концентрация клеток бактериальной популяции достигает 1,0 г сухого веса на 1л. Из этой популяции выделяют один штамм бактерий, утилизирующих молекулярный азот и метан; присутствуют в ней и другие типы бактерий, не утилизирующих Метан. Соотношение клеток бактерий, утилизируюих метан и молекулярньШ азот, и клеток бактерий другого типа составляет 90-95% (по количеству). Бактерии, утилизирующие метан и азот, представляют собой капсулообразные кокки с диаметром 1,, 4 мк неспособные утилизировать глюкозу. На твердой среде, приготовленной путем добавления 1 вес./об. агара к ферментационной среде, после инкуби рования в течение 10 дней при 45с в атмосфере метан-воздух (50/50 по объ му) колонииимеют следующую морфологию. Диаметр 1 мм, белые, гладкие, округленные. По этим характеристикам они сходны с MethyEocof-Cuc topsuEatuS но в отличие от них они утили зируют молекулярный азот (как источник азота), метанол и не образуют ци или остаточных стадий. В . Стадия развития культуры. Бак терии, утилизирующие азот и метан, п лученные в фазе выделения, выращиваю при 45°с и 5,0 л Питательной среды следующего состава, мг/л: КНзРОц NajHPOijMaH O M SOj-THaO (безводный) NajSOij (без водный) CtjSO(j-5H20 ZnSOfjTHjO ЫагЛА00 2НаО MnSOij HjO СоСЕг ЬНгО . 0,5 Вода ДО 1 л Скорость разбавления 0,18, перемешивания 3000 об/мин-. Культивирование осуществляют при подаче метано-воздушной смеси, соде жащей 18,2 об.% метана и 18,8, об.% воздуха. рН 6,5 поддерживают при по мощи NaOH и регулируют добавлением 1,0%-ного раствора NoOH. Дзот в вял,е 1,1 н. гидроокиси aMT-iOHHH подают в ферментатор при постепенно возрастаюспей скорости для подцержаиия 1ОНЦ : трации клеток 13 г сухого веса на 1 л. Избыток концентрации ионов р питательной среде определяют изветным колориметрическим способом я прО бах по 10 мл бульона через каждне 5 мин. Избыток ионов аммония в среде поддерживают на уровне 5-10 мг/л пзгулированием скорости подачи гидроокиси аьчмония в ферментатор. После достижения концентрации клеток 13,7 г сухого веса на 1 л культивирование продолжают еще 24 ч. На этом этапе скорость подачи гидроокиси а мония Р Ферментатор поддерживается постоянной. Скорость продуцирования бактерклльных клеток составляет 13,,18 г (су хсй вес) на. 1 л в 1 ч. йлход по i-этану, т.е. вес клеток, продуцировзннык на единицу веса метана, подаваемого в ферментатор, составляет 0,63. Выход по кислороду - 0,23. Ш . Стадия получения готового продукта. Подачу в ферментатор гидроокиси аммония снижают в три стадии: на 30%, на 65%, на 100%. Во всех случаях ферментация восстанавливэется через несколько часов при более низкой концентрации клеток и необнаруживаемоР. низкой концентрации ионов ам.тония в среде. В таблице приведены данные, полученные при установившейся непрерывной работе на каждой стадии при избытке иона акздония в среде (5-16 мг/л), а также данные контрольного опыта (получение биомасс, по известному способу) .

Подача азота в виде аммиака, мг/л.ч

Выделено азота в виде

протеина, мг/л-ч

Потери азота в ферментаторе в виде аммиака в отработанной среде, из расчета наличия 2 мг/л ионов аммония, мг/ЛЧ

Чистое поглощение микроорганизмами азота, подаваемого в ферментатор в виде аМмиака, мг/л«ч

288,000

64,000

204,000 286,000

219,000

2,040

0,330

286,000

63,700

Продуцирование клеток,

г/л-ч2,070

Прибор с пределом чувствительности 2 мг/л не обнаруживает ионов аммоСуммарное содержание азота в клетках,% на сухое ведество

Содержание готсовой биомассы в клетках,% на сухое вещество (количество азота, помноженное на 6,25) Формула изобретения 1. Способ получения бисймассы путем непрерывного культивирования метанути лиэирующих микроорганизмов в жидкой питательной среде, содержащей ассимилируемые источники азота и минераль ные соли, при подаче метано-воздушной смеси, отличающийся тем, что, с целью частичной замены связанного азота в форме аммонийных или нитратных солей молекулярным азотом атмосферы или полного исключения из сре;цы. с%яван-ного азота, в качестве метанутияй51йрУющих микроорганизмов используйт микроорганизмы из рода

Продолжение табл.

2,470

1,770

1,890

12,000 ния

11,500 11,600

11,600

71,900 72,500

72,500 Methytococcos , обладающие способностью фиксировать атмосферный азот, при этом количество связанного азота в питательной среде регулируют таким образгал, чтобы его уровень в среде в процессе выращивания был меньше того количества, которое содержится в готовой биомассе.. 2. Способ по п. 1, отличающ и и с я тем, что из рода MetViyEocoCeitf используют вид cap&otatas . Источники информации, принятые во внимание при эке11ертизе 1. Патент Великобритании 1150401 кл, С 6 F , 1969.