Способ получения биомассы Советский патент 1979 года по МПК C12D13/06 

1

Изобретение относится к технике получения биомассы на .питательной среде, содержащей метан в качестве источника углерода.

Известен способ получения биомассы, предусматривающий выращивание смешанной культуры бактерий на питательной среде, содержащей метан в качестве источника углерода, источник азота и необходимые минеральные соли, в условиях аэрирования газообразной смесью,содержащей свободный кислород и метан, с использованием в качестве метан-потреблявощих микроорганизмов бактерий из родов Methy lomonas, Methylobacter, Methylosinus или Methylococcus 1.

Недостатком известного способа является повышенное образование пены в -процессе выращивания.

Целью изобретения является снижение пенообразования в процессе выращивания микроорганизмов.

Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения биомассы осуществляют одновременное выращивание культуры .бактерий, потребляющих метан, с одной или смесью бактериальных культур из родов Acinetobacter, ,AIcaIigenes, Agrobacteriuirt Mcuraxella

Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Miterocpccus ijJiH Pedigcpcciis не потребляющих метан и использующих пёнообразующие продукты метаболизма культуры бактерий, потребляющих метан.

При этом В качестве культуры, потребляющей мётан, используют бактерии вида Methylococcus capsulatus.

Кроме того, в качестве культуры, Ьотребляющей метан, исп эльзуют штамм NCIB (110856 M.capsulatus.

Кроме того, в 1 ачестве культуры, потребляющей метан, используют штамм АТСС №19069 М.Capsulatus. При этом, в качестве культуры,

потребляющей пенообраэующие-вещества/ используют штамм Moraxella NCIB №11135.

Кроме того, в качестве культуры, потребляющей пенообразующие вещества, используют штамм Alcaligenes, Agro- .bacterium или Pseudpmonas NCIB «шЗб.

Кроме того, в качестве культуры, потребляющей пенообразующие вещества, используют штамм Alcaligenes, bacterium или Pseudomonas NClg W11137.

Кроме того, в качестве культуры, .потребляющей пенообразующие вещества. .используют штамм Alcaligenes или P seudpmonas NCIB №11138. Кроме того, качестве культуры, потребляющей пенообразующие вещества используют штамм AlcaiigenesNCIB №11139. КрЪме того, в качестве культуры, потребляющей ценообразуюЩйе вещества испол ьзуют штамм Acinetobacter NCIB 7win4o. - --- . - ..,. .- -- ..,....v,.---™-... - А также, кроме ттэго, в качестве .культуры, потребляющей пенообразую 1цйё йёщества, используют штамм Mcaligenes, Agrobacterium или ,Р seudpmonas NC IB № 11141. Прй этом процесс, выращивания осуществляют при рН 5,5-7,0 и 305,. - . Кроме того, концентрацию ионов ам V мония в питательной среде в процессе выращивания поддерживают 2-50 мг/л. Способ осуществляйт следующим образом. Смешанные культуры бактерий из ро дов Methyioinuhas,MethyIobacter, Methyiosinus или Methylococcus выращивают на питательной среде, содержащей метан в качестве источника углерода, ист эчник азота и необходи Ше минёрал ьныё с.оли. -- - . Для снижения пенообразования в процессе выращивания осущеетйляют одновременное выращивание культуры бактерий, потребляющих мётан с одной или смесью бактериальных культур из Acinetobacter, Alcaligenes, Agrobacterium, Mbraxella, Pceudomohas, Flavobacterium, Bacillus, Micro coccus или Pediococcus не потребляю ВДх и использующих пенообр1азую Щйёпродукты метаёолйзйа культуры Вактерий, потр1ебляйщих метан. При этом в качестве культур, потребляющих метан, используют бактерией вида MethyTocddcus capsubatus, штамм NCIB №10856 M.capsulatus, штамм АТСС №19069 M.capsulatus -; В качестве культур, потребляющих Г пенЬобр зП йШё веШестваТйГбТГбльзуШ шталш Moraxella NCIS №11135, NCIB . : №11136, NCIB №11137, NCIB №11138 и йТаммы Acinetobacter NCIB №11140, Alcaiigenes NCIB №11139 и штамм NCIB №11141.« Процесс выравнивания осуществляют при рН 5,5-7,0 и 30-55с, а концентр йомов аммонйя в питательной сре де в процессе выращивания;поддерживают 2-50 мг/л. Процесс проводят в условиях аэри рования газообразной смесью, содерж щёй св1ободный кислород-и метан, при этомколичество метана обычно равно 16 объемам к 84 объемс1м воздуха, оно может быть также равло от 8 до 40 , объе мовЛк 92-60 объёмам вЬздуха. м е р 1. Смесь бактерий штам АТСС 19069 Methylococcus capsu .latus, потребляющих метан и элементарный азот, ибактерии, потребляю.щие пенбобразуюЕцие аещества, образованные ЭТИМИ бактериями, культивируют в 5 л (рабочий объем) бульона, содержащегося в семилитровом ферментере. Процесс ведут непрёрйвиб не асептически, температуру поддерживают , перемешивание проводят смесителем при скорости вращения 1000 об/мин. К бульону добавля питательную ереду при степени разбавления 0,18 час .следующего состава, мг; КН.НРО 175,0; Nag.HPO. 12 - 150,0; MgS04-7H20 - 85,0; CaCI.(безводный) 20,0; CUS04-5H20 - 20,0; ГеЗОд7Н,О 7,5; 2пЗОд ,7Н О - 0,5; 0,5; CoCl26H2 0 - 0,02; Na«MoO,. 2H2O0 , 2 ; , ; дистиллированная вода до 1 л. рН регулируют 6,4, используя 2,0 н.раствор гидроокиси натрия, азот вводят в виде гидроокиси аммония и воздуха, при этом количество гидроокиси аммония вводят из расчета удовлетворения потребности в азоте присутствующих бактерий на 95% а оставшиеся 5% удовлетворяют азотом воздуха. Метан подают при скорости 6 об/об«час и возцух -. при скорости 24 об/об час. Ферментация идет стабильно, при этом получают плотность клеток 3,4 г/л при производительности 0,61 г/л час. . Во всех примерах вес клеток выра-жен через сухой вес. Образование пены бактериялш не обнаруживают. Затем концентрацию водной питательной среды и гидроокиси аммония уДваи- . вают, что приводит к увеличению плотности клеток до 6,5 г/ли производительности до 1,7 г/л час. Пена не образуется. Бактерии, присутствующие в бульоне состоят 3 85% клеток штамма АТСС 19065, потребляющих метан и элементарный азот бактерий Methylococcus capsulatus, и из 15% леток смеси, не потребляющих метан бактерий. Последнйе выделяют путем разбавления образца бульона до 10, нанесения разбавленного образца на агар в чашке Петри и инкубирования 48 час при в аэробных условиях в отсутствии метана. Отдельные колонии снимают: с агара .и непрерывно пересевают всвежую среду до получения.чистой культуры. Полученные культуры были внесены в национальную коллекцию промышленных бактерий Аберден; (Шотландия) под номерами: 11135, 11136, 11137, 11138, 11139,- 11140 и 11141. Затем бактерии идентифицируют в соо.тветствии с существующей классифйкаййей. Данные приведены в табл.1. Смесь- не потребляющих метан бактерий состоит из 3% клеток неидентифицированных г4)амкшзменчивых бактерий в форме палочек Штамм NCIB №11134 и 12% смеси, состоящей из

штамма MoraxellaNCIB 11135, штамма Alcaligenes, Pseudomonas или Agror bacterium NCIB.iri36, штамма Pseudomonas или Alcaligenes NCIB W11138 штамма Acinetobacter NCIB №11139, ртамма Acinetobacter NCIB №11140, штамма Pseudomonas, Alcaligenes или Ayrobac-terium NCIB №11141.

Для сравнения процесс проводят при культивировании в асептических .условиях в присутствии микроорганизмов, потребляющих метан и элементарный азот, Methylococcus capsulatus АТСС 1 19069. Процесс проводят непрерывно при скорости разведения 0, при плотности клеток, на-пример 3,3 г/л, и производительности 0,59 г/л час.

Ферментация идет нестабильно изза образования пены культурой, что приводит к трудностям регулирования уровня в ферментере и достижения стабильности проведения процесса. Пена уменьшает также объемную проnyqKHyro способность так, что не обеспечивается постоянный вывод получаемого вещества

Затем концентрацию питательной среды удваивают, что приводит к увеличению плотности клеток до 5,5 г/л и обильному образованию пены с последующим прекращением процесса. Характеристики штаммов приведены в табл.1.

Характеристики других штаммов приведены в табл.2.

Таблица 1

Микроскопи Морфология ГДСА Окрашивание Граму МеМе О/Ф глюкоза Подвижность Аргенин Аммонийные с.ахар- маль Аммонийные сахар-этано

Твин 80 гидролизный Палочки 0,35-0,5 х 1l,25ju скругленные концы, края параллельные, некоторые слегка изогнуты, единичные, некоторые цепочки содержат до 8 клеток. Круглые, гладкие, блестящие, диаметр закругленного выступа 2-3 мм, край с,ш1ошной, бежевые с желтсэватой серединой. Как ГДСА, НС иолупрозначные с серыми вкраплениями. Палочки О,35-0,5 х ,25-1,5/J параллельные стороны, единичные. Круглые, глгшкие, блестящие, малая изогнутость при уколе иглой, край сплошной, полупрозрачные светлокоричневые, обширные колонии на агаре. Как ГДСА, но диаметром 1 мм.

Таэжижение желатина ОНГ1Г Оксидаэа-чашкафильтровальная бума Рост наагаре Мак-Конка Малонаг

Рост в цианистом калии

Уреаза Каэеиназа Каталаза

Т:ёрс водород Индол Ацетйлметилк арби нол

Врсстановление а

Чувствительность к нициллину 2,5 иммун единиц

Анаэробный рост ГДС

Mf агар + 0,2% глюк

Рост на araps C в 50%-ном метане

Рост на агаре МС в парах бутанола

|« 11 в парах ацетона

-I «. « | в парах метанола

|1 1 в парах ;эт;анрла . . .|| «t в парах

- -- -

„I - в Ларах

формальдегида

Рост на агаре МС в Гмуравьиной кислоты

«. агар 0,2% (в глюкозы

667154

8

Продолжение табл.1

+ f

+ +

--в жидкой МС без добавок

-- плюс 0,2% глюкозы

плюс 0,2% арабинозы

-- плюс0,2% галактозы

-- плюс0,2% лактозы

-- плюс0,2% ксилозы

-- плюс0,2% сукрозы

--плюс0,2% маннитола

-- плюс0,2% глицерина

-- плюс0,2% салицина

-- плюс0,2+ лаквулозы

Наличие Flagella

(электронномикроскопиЧески)

Споруляция в марганцевой среде Микрбско- Палочки Палочки 0,35-0,5х 0,5 л IfS 0,5 х 1,5пкческийх1,25, скругленные единичные вид. скругленконцы, па- или спараллельныв ренные, ные конкрая несколько цы, единичные . или спаренные

Круглые, гладкие, блестяищие , малая выпуклость1-2 мм, диаметр 2-3 мм, края

сплсшные, бежебые

Н Н НИ

1 боковая

iT а б л и ц а 2 Палочки короткоцепрчныхПдеоморфные Плеоморфяые Палочки палочки, 0,35 х палочки, 1скругленны х 1,75 концы округлые, .стороны края не ч параллель- шараллельстороныпараллельныеныеные, едияичные

11

Нерегуляр- Переменное ные пятна окрашивание, биполярно

темное

щел

щёл

( + )

.

+

667154

12

Продолжение табл.2

ПеременноеПеременное

нерегуляр-окрашиваное окра-ние шивание

ПеременноеПеременноеПеременное нерегуляр-нерегуляр-нерегулярное окра-ное окра-ное окрашиваниешиваниешивание

щел

щел

щел

( + )

+ +

+ +

Сероводород

Индол

Ацетилметилкарбинсш

Восстановление нитрата

Чувствительностьк пенициллину в 2,5 имунные единицы

Анаэробный рост ГДСА

МС агар + 0,2% глюкозы

Рост-на агаре МС в 50%-ном метане.

Рост на агаре МС в парах бутанола - - в парах ацетона

- - в парах метанола

-- в парах этанола

-- в парах этана

-- в парах формальдегида

Рост на МС в парах муравьинойкислоты

15

:гт-: ;

плюс

0,2% арабинозы

- плюс ,0,2% га.лактозы

-.««.

плюс

о ,2% лактозы

0,2% ксилбзы I

плюс 0,2% сукрозы.

- Ч «.

плюс

0,2% маннитола

ПЛЮС

о,2«глицерина

плюс Of2% салицина

-.««

плюр

0,2% левелозы

667154

16

Продолжение табл.2

f

о-ф- окисление/ферментация

ГДСА глюкоэо-дрожжевой сыпучий агар: глюкоза - 5 г, пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, ;сычужныйфермент - 10 г, агар - 20г, дистиллированная вода - 1000 мл

Автрклавирование при iS f№H.

ПИ - питательный агар (оксоид СМЗ)

МС - минеральная среда (жидкая или твердая) при JO с на скошенном питательном агаре. Основание жидкого скошенного агара помещают в стерильную дистилли рованную воду. Рост культуры после инкубации оценивают на поверхности раздела воздух-вода при помощи фаэово-концентрационной- микроскопии. Марганцевая среда для споруляции чашки со скошенным питательным агаро в который добавляют 2 мг/мл ионов Мп в виде сульфата марганца. Культуры инкубируют до 14 дней при 30°С а затем инокулируют спорами. Культуры также оценивают на зйГзнеспособность После воздействия температуры 80°С 10 мин. Пример 2. В cTepH bHSft epo дИльный чан емкостью 7 л помещают 4500 мл стерильного водного питатель ного раствора. Состав водной питатёЛьнЬй среды, как описано в прйМере 1, с добавлением;1,770 г/л азотной кислоты. В бродильный чан вводят 500 мл активно растущей культуры микроорга низмов Methylococcus capsulatus АТСС №19069, использующей метан и элементарный азот, обеспечивают его периодическую работу в асептических условиях со скоростью перемешивания 500 об/мин, скоростью аэрации 10 об/об час, расходом метана 10 об/об час, рН поддерживают на уровне 6,5 добавлением 1,0 г/л раст вора гидроокиси натрия или 3,6 н. раствора серной кислОты в з аВйсймЬс ти от условий. При достижении клетками плотности 1,0 г/л скорость перемешивайия повышают до 1000 об/мин Затем работу чана переводят на непрерывный режим при скорости разбав ления 0,05. Через 12 ч непреры ной работы скорость разбавления повышают до . о./об час, а расход метана -: О .:. рб/Ьб. час. Eirie через 15 час ;скбЕ)Ост% .разбавления повьлшаю до 0,18часг ; В1хЗтность клеток составляе -й; 3 iv, а скорость образованийг-Йзйшлерно 0,59 г/л -час. р.ежим.,% аботы нестабильный из-за пены, ,р;4рЬ.зующейся при росте культу ры. Пена препятствует стационарному режиму работы. На этой стадии асепт ческие условия нарушаются, а через двэ часа неасептичёской работы Ьбрэ jaaHHe пены снижается и в культуре обн аруживают некоторые виды бактерий. Через 24 час. режим работы устана ливается при плотйрсти клеток 3,4 г/л,- а скорость образований сос тавляет 0,61 г/л«час. Образование пены больше не наблюдается.при анализе бульонной культуры обнаруживают бактериальную культуру как в примере 1. Пример 2 показывает, что пенообр зование можно эффективно снизить в присутствии смеси микроорганизмов. При.мер 3. В семилитровый бродильныйчан помещают 4,5 л водной питательной среды следующего состава, мг: HNGj - 3500,0; КН,РО.- 350,0; NajHPQ,} 12Н20 - 300,0; MgSO. 7Н20 170 CaCEj(безводный) - 40,0; -4,0; FeSO. CuSO -Л j 2 1 f -f, i: t: j 7 H 15,0; ZnS047H20 - 1,0; СоСегбН.О - 0,04; Мп304-Нз,О - 1,0; Na2MoO -2H2O - 0,4; дистиллированная вода до 1 л. рН среды доводят до 6,4 добавлением 2,0 н.водного раствора гидроокиси натрия, затем в бродильный чан вводят 500 мл выращенной в асептических условиях культуры Methylococcus capsuIatus АТСС №19069 и обеспечивают его работу по периодическому режиму со скоростью перемешивания 1000 об/мин при 45С, расходе воздуха - 10 об/час и метана - 10 об/обчас. ч рН среды поддерживают на уровне 6,4 добавлением 2,0 н.водного раствора гидроокиси натрия или 3,6 г раствора серной кислоты, используя устройство для автоматического титрования. По достижении плотности клеток 2,0 г/л режим работы переводят на непрерывный, вводя водную питательную среду HenpejjfcJBHo в бульонную культуру и отводя ее со скоростью, обеспечивающей постоянство рабочего объема в бродильном чане объемом 5 л. Начальная скорость разбавления составляет 0,05 час. По мере повышения плотности клеток скорость перемешивания, расход мётана и расход воздуха постепенно повышают и через 36 час, скорость разбавления составляет 0,18 час, скорость перемешивания - 2.000 об/мин, расход воздуха - 48 об/об.час и расход метана - 12 об/об«час. На этой стадии к водному раствору, не содержащему азотной кислоты, добавляют водную-питательную среду. Новый раствор имеет следующий состав, мг: - 700; На НРОд12Н,0 600; - 340; CaCIj Гбезводный) - 80; СиЗбд. - 8; ,jO- 30; - 2; МпЗОд НзО 2; CoCl2 6Hj,0 - 0,8; Ка2МоОд2НдО 0,8; дистиллированная вода до 1 л. К бульонной культуре отдельно добавляют азот з виде гидроокиси аммония в количестве 95% для роста микроорганизмов. СКОРОСТЬ введения определяют, устанавливая плотность клеток растущей культуры (методом оптической плотности) и используя плотность клеток для измерения скорости связывания азота биомассой. Остальные 5% азота вводят вместе с элементарным азотом воздуха, подаваемого в бродильный чан. Еще через 60 час достигают стационарного состояния при плотности клеток 11,67 г (сух.вес) на литр и скорости образования 2,1 г/л час. При росте культуры пенообразования не 21 |наблюдается. Бактериальный анализ бульонной культуры показывает наличие того же вида, как-в примере 1. Пример 4. Полностью повтор ют методику, как описано в примере но используют штамм Methylococcus capsulatus NCIB №10856. Новый выделяют из образца грунта. Стационарное состояние процесса достигают при плотности клеток 13,14 г (сух. вес) на л/час, что соответствует ск рости образования 2,4 г/л час. Образования пены не наблюдают вид бактерий аналогичен виду примера 1, за исключением того, что использующим метан видом микроорганизмов явля ется Methylococcus capsulatus NCIB №10856.

Концентрациябиомассы в бульонной культуре, поступающей в центрифугу, г.веса сухих клеток на литр

Концентрация биомассы в потоке, выходящем из центрифуги, г.веса сухих клеТок на литр

Количество биомассы из 1 л бульонной культуры, г.веса сухих клеток на

Из результатов табл.3 видно, что биомасса эффективно извлекается при центрифугировании бульонной культуры, содержащей новый вид микроорганизма Methylococcus capsulatus NCIB №10856, тогда как из бульонной культуры, содержащей известный штамм .АТСС №19069, извлекается только 97,5% биомассы.

Из представленных данных также видно, что при равных условиях производительность в случае использования нового штамма NCIB №10856 3ittaчительно выше по сравнению с известным штаммом АТСС №19069.

Кроме того, новый вид штгилма имеет более высокий выход по метану по сравнению с известным.

10,50

12,90

13,14

0,0015

0,0015 0,26

Новый вид Methylococcus capsulatus NCIB №10856 образует меньшее 50 .количество капсулированных полисахаридных материалов на единицу веса биомассы по сравнению с известными видами. - - - 55

Формула изобретения

60 среде,содержащей метан в качестве источника углерода,источник азота и нербходимле минеральные соли,в услови;ях аэрирования газообразной смесью, содержащей свободный кислород и метан, с использованием в качестве

65 Выращенную в стационарных условиях бульонную из бродильного чана помещают в центр1яфугу непрерывного действия (Шарплесс тип 16) с загрузкой 17 кг, центрифугирование осуществляют при двух различных расходах5571 мл/мин и 774 мл/мин. Концентрацию бйом ссы ТГ пбтЬкёТ выходящем из центрифуги измеряют в пересчете на вес сухих клеток на литр. Затем на основе веса сухих клеток определяют вес биомассы, выходящей из центрифуги. Сравнительные данные центрифугирования культур, содержащих штаммы Methylococcus capsulatus АТСС №19069 (пример 3) и штс1мм Methylococcus Capsulatus NCIB W10856 (пример 4) приведены в табл.3. Та б л и ц

метан-потребляющих микроорганизмов бактерий из родов Methylomonas, l ethyiobacter, Methylosinus или MethylQcoccus, отличают и йс я тем, что, с целью снижения пенообразования в процессе выраадвания, осуществляют олновременное выращивание культуры бактерий, потребляющих метан, с одной или смесью бактериальных культур из родов Acinetobacter, Alcaligenes, Agrobacterium, Moraxella, Pseudomonas, Flavobacterium. Bacillus, Mibrocqccus или Pediococcus не потребляющих метан й й сп5льэующих пенообразующие продукты метаболизма культуры бактерий, потребляющих метан,

ч а ю щ и и с я тем, что в качестве культуры, потребляющей пенообразуюцдаё вещества, используют штамм Alcaligenes, Agrobacteriuin или Pseudomonas NCIB 11136.

, 7. Способ по пп. 1-4, о т л ич а ю щ и и с я тем, что в качестве

культуры, потребляющей пенообрйзующие вещества, используют штамм Alcaligenes, Agrobacterium или Pseudomonas NCIB №11137.

IP. Способ по пп. 1-4, о т л и ч и ю щ .и и с я тем, что в качестве культуры, потребляющей пенообразующие вещества, используют штамм Acinetobacter NCIB №11140.

Источники информации, принятые в внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР №421199, кл. С 12 D 13/06, 1974.