Способ получения биомассы микроорганизмов Советский патент 1982 года по МПК C12P19/04 C12Q1/64 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается сп соба получения биомассы микроорганизмов и гетер х1олисахаридно1ч биопотмера. Получаемая биомасса может быть ис- . пользована как кормовой продукт, а биополимер - как загуститель в пишевых продуктах или в нефтяной промышленности для применения в буровых растворах, или при разработке подземных торфяных |Q месторождений.

Наиболее близким по технической сушности и достигаемому результату к изоб- , ретению является способ получения биомассы MHKpoopraimaMOB, предусматриваю- |д ший культивирование в аэробных условиях в присутствии газообразного метана на жидкой питательной среде, содержащей источники азота и минеральные соли, метаниспольауюшего микроорганизма о

,MettTS OTnoncjs в присутствии метанописподьзуюшего микроорганизма Pseudomonas R H cobactfriDm с последуюишм выделе ием микробнсД биомассы из кудьтуральной жидкости, при атом температу- jj

ру культивирования поддерживают в интервале 38-45С, а рН регулируют в интервале 6,4-7,4. Способ можно осушествлять периодически и непрерывно, .хсд бисмассы составляет 2,5-6 г/л. Биомассу сушат вымораживанием или распылительной сушкой. Полученную биомассу можно использовать в качестве источника белка, добавляемого в корма животным или при приготовпеиии продуктов питания подей 11.

Однако выход, получаемый при осуществлении известного способа, недоствточно высок.

Цель изобретения - получение наряду с биомассой и гетеропописахаридиого биополимера и повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цвш достигается тем, что согласно способу получения биомассы микроорганизмов, предусматривающему культивирование в аэробных условиях в присутствии газообразного метана на жидкой питательной среде, содержащей источники азота и минеральные com.

метаниспопьзуюшего микроорганигя ла We tiiEnmoTOS в присутствии метанописпопьауюшего микроорганизма Pseudomonos с последующим выделением микробной био массы из купьтуральной жидкости, в качестве метаниспользуюшегЬ микроорганизма испопь ют штамма Met Tl2omon as meit ahicci НКПБ Me 11221, образующий гетерополисахаридкый биополимер, а в качестве метанолиспользуюшего микроорганизма используют штаммы PSSodoraonas maetoptiitiq НКПБ № 11230 и/или PseoSomonas flialtopltiU q НКПБ № 11255, и/иш PseO(3ionK)wa5 roqEtDphitAO НКПБ 11257, и/ипи Feavotactepiom Strain НКПБ-№ 11254 и/нпиf avobaote Йога НКПБ - 11256, и/или PtqvobQcterium Streivn НКПБ № 11258, .и/или fEavobactepium straVn нкПБ hfe 11229, при этом дня выделения гетеропописахаридного бйстопимера из купьтурапьной жидкости последнюю нагревают до 50-9О С..

Для осушествяения способа используют специально подобранный метаниспопьзуюший штамм Mei Sotnottos matl artAca НКПБ М 11221, который продуцирует розовый (красный) пигмент и придает т полученной биомассе акет мяса. Этот штамм в качестве источдака азота может использовать элементарный азот,

В качестве метанолиспопьзуюших микроорганизмов исполь ют iartfMMt бактерий из родов Рзеиботопчви FeavobacterAum которые представляют собой подвижную или неподвижную грамотриоатепьную палочку, которая может расти на такой питательной среде, как агар. Эти штаммы переданы в Национальную коллекцию промышленных бактертй (Г. Абердин,

Шотландия), где им присвоены соответст вуюшие номера

Способ можно осушествлять либо не прерывно, либо он может включать как непрерывные, так и периодические стадии Предпочтительно осушествлять способ непрерывно в условиях установившегося режима, с включением или без последующей стадии периодического култивирования.

рН бульона на протяжении культивирования обычно поддерживают в интервале 5,О-8,0, предпочтительно в интервале 6,,О. Для поддержания желаемой величины рН в бульон можно добавлять такие шелочи, как гидроокиси шапочных металлов, или гидроокись аммония, или аммиак. Когда для поддержания рН испольагуют

аммиак или гидроокись аммония, то п качестве источника азота могут служит также ионы аммония; Когда ноны аммония присутствуют в концентрациях, превьшлаюших определенный пороговый уровень, то они ределенный пороговый урювень, то они могут ингибировать рост или снижать скрость роста бактерий, усваивающих мета и образующих биополимер. Концентрация ионов аммония в бульоне не должна превышать 100 мг/л и, предпочтительно должна быть в интервале 2-50 мг/п.

Температура может быть в интервале 25-55°С. Обычно процесс проводят при температуре в интервале 28-35°С.

Газом, содержащим свободный киспород, является обычный воздух. При непрерывном способе и промышленноприемлвмых выходах продукции используют отношение в смеси метан/воздух таким, чтобы соотношение газа, содержащего метан, к подаваемому в бупьон воздуху находилось в интервале, который соответствует отношению от 1 объема метана к 2 объемам кислорода до 2 объемов метана к 1 объему кислорода. Предпочтительным соотношением является отношение 1 объема метана к 1 объему кислорода.

Установлено, что двухстагшйный процесс приводит к повьпиению выхода биополимера. На первой стадии купьтивировакие является непрерывным. Культивируемый бульон, получаемый на первой стадии, подвергают на второй стадии периодическому культивированию в присутствии газа, содержащего метан, и газа, содержащего кислород, в таких условиях, что рост усваивающих метан и вырабатывакицих биополимер бактерий штамма Meth Comonde ограничен за счет уменьшения или отсутствия других источников питания, кроме метана или кислорода. Таким источником питания может быть такой источник азот-а, как нитрат.

Когда используют один фермент, и пи когда способ осуществляют в две стадии ферментер или ферментеры обычно могут содержать один или более импеллеров и систему труб для продувки для достижения хорошего перемешивания и высокой скорости передачи газа.

Биомассу можно выделять из культивируемого бульона с помопшю центрифугирования либо фильтрованием. Биомассу перед центрифугированием или фильтрованием можно осадить или флоккулировать для облегчения выделения. Подходящими осаждающими ипи флоккулирующими агентами явпяются такие ней тральные соединения, как спирты, кетоны, простые эфиры и такие ионнь1е сое- дине ни я, как соли четвертичного аммони я. Таким образом, выдеяеннан биомас са может быть смешана ипи свободна от биополимера. Способ выделения определяется требованиями к выделяемому продукту. Так например, способ, состояший в центрифугировании, можно испопь зовать для получения биомассы, свободной от биополимера. Можно ис1гопьэовать .известный спосо выделения из водных растворов полисаха ртдных полимеров для ы 1деления гетеро полисахаридного биополимера из кулыуральной жидкости (бульона) осаждением, фильтрацией или центрифугированием. Пе ред выделением биополимера купьтурага ный бульон нагревают до 5О-ЭО С и иэ него удаляют основную массу ми1цх бных клеток (биомассу). В результате анализа образцов биопо лимера получены данные по содержанию остатков в расчете на полный вес сахарида, %: Глюкоза 38-48 11-2О Фуккоза 7-21 Манноза 11-18 Галактоза Уроновая кислота 1О-2О или более точно, 38-48 глюкоза 16-2О Фуккоза Манноза 6,5-12 Галактоза 12-18 1О-19 Уроновая кислота Остатки сахаридов, главным обраэом связаны в ГЬ -конфигурации. Мопехулярный вес гетерополисахаридов может cogставлять величину в интервале б. 2,5 X Ю , предпочтительно в интервале 1,О)10 -200Х1О по данным гепь-проникаюшей хроматографии. Обычно удепь ное вращение полимера составляет (dL)i}o менее, чем 1О . Пример 1. 2О л водно питательной среды следующего состава: 100,0 МГ НзР04 4,0 МГ 388,O МГ 28,O МГ 53,О.мг Mq S04-7H(jp Ca(N07)i4Hi O 20,0 МГ CuSO4-5HiiO 1,6 МГ 2,4 МГ FeS04.7H,lp 2j S04-7H(jp О,9 МГ 0,16 МГ MnSO4-HlO Co(NOj).,14 МГ NariMoO4-2H(iO0,44 мг еььоo.oi мг H-jBOj-GHoG0,20 мЬ Дистиллированная водаДо 1 л добавляют в ферментер, полная емкос1ъ которого составляет ЗО л. Ферментер снабжен импеллером для перемешивания бульона и приспособлениями для аэрацци и подачи метана в бульон. Указанную среду перемешивают при скорости импеллера 500 об мин. Величину рН устанавливают 6,6 и поддерживают с помошью автоматического приспособления .для титрования, добавляя 2,0 н водную гидроокись натрия. Поддерживают 30°С, а воздух и метан подают со скоростью 3 об/об/ч и 150 об/об/ч соответственно. Скорость разбавления О,О5 ч достигают, отводя среду со сксфостью 1,О л/ч и поддерживая постоянный рабочий объем в ферментерю за счет добавления свежей водной питательной среды. Воздух и метан, подаваемые в ферментер, не подвергают стерилизации, так что процесс проводят в нестерильных условиях. Ферментер инокулирдгют каждый день в течение 7 дн. порциями по 1ОО мл отдельно приготовленных образцов, которые содержат метаниспользующие микроорганизмы. Офазцы приготавливают следующим образом. 5 мл образца почвы, ила и воды из пруда, взятые из такого места, где можно ожидать нагшчие использующих метан микроорганизмов, добавляют в 1ОО мл среды NM5.Среду NtAS приготавливают по известному рецепту. Затем каждую колбу закрывают пробкой Сабасил. 5О мл воздуха в копбе заменяют с помощью щприца 5О мл метана. Затем инкубируют на вращающемся вибростенде пря 30°С в течение одной недели. Газовую фазу в колбах обновляют каждые 2 ди. Спустя неделю в ферментере в питательной среде наблюдается рост микробов .Спустя 5 дн. скорость подачи метана понижают, а скорость подачи воздуха, скорость перемещивания скорость разбавления, давление в ферментере и концентрацию солей в подаваемой минеральной среде для ферментации постепенно увеличивают до получения скорости подачи воздуха 12О об/об/ч, скорости подачи метана О,О75 ч,давления в ферментере 0,7 бар по манометру и концентрации питательных солей в среде,в 18 раз провышающей исходную. За этот период времени, пока осушествпяют эти изменения, концентрацию кислорода, растворенного в бульоне, поддерживают не превьпиаюшей величины, соответствующей 10% насыщения воздухом. В этих условиях был достигнут установившийся режим. Бульон при этом розово-красный и вязкий. Концентрация микробных клеток 12,0 г сухого веса на 1 п. Образец, взятый из бульона, подвергли центрифугированию при ЗОООО в течение 3 ч, в результате этого получили, с одной стороны, твердую фракцию, окрашенную от розового до красного цвета, состоящую, главным образом, из микробных клеток с некоторым количеством гетерополисахаридного биополимера, ас другой стороны - водную надосадочную жидкость, вязкую и почти бесцветную. Надосадочная жидкость содержит растворимый гетерополисахаридный биополимер, который осаждают, добавив такой полярный растворитель, как изопропанол, этанол или ацетонi После 5ОО ч работы в установившемся режиме, образец бульона, взятый непосредственно из ферментера, инокулируют на NMS скошенный агар и инкубируют в герметичные пластиковые контейнеры, содержащие атмосферу 1:4 метан/ /воздух при 30°С в течение 7 дн. На агаре развивалась смесь культур, содержащая, по крайней мере, один микроорганизм, усваивающий метан и вырабатываю щий биополимер. Культура была розовокрасного цвета и по внешнему виду напоминала слизь. Анализ культуры показал, что она состоит на 8О% штаммов бактерий lAett :iSomonas усваивакядих метан и элементар ный азот и образующих гетеропояисахаридный биополимер, который был признан штаммом Melh-siEomonots mfttlnaniCQ НКПБ № 11221, и 2О% смеси гетеротропных бактерий, включая, по крайней мере, один штамм . штамм Pseodorrroncis maKtoptiitia и несколько невдентифицированиых штаммов, похожих на виды Рееоботпопаз и ABcaCicjenes. Из этой смеси были выделены н идентифицированы штаммы F qvobauier om Strain НКПБ № 11229 и штамм Pseodomonas НКПБ М 1123О. Каждый вз штаммов бактерий был ваыдепея в чистую культуру. МетаниспопьвукятЛ и образующий биополимер штамм бактерии УАе1Гг отт опо« rneihanica НКПБ М 11221 был культивирован, охарактеризован и идентифицирован в соответствии с известной методикой. Гетеротропные бактерии были идентифицированы в соответствии с известной методикой. В табл. 1 приведена характеристика Methyleomonas те ъаплса НКПБ № 11221, илделенного из ферментера при скоростях разбавления 0,03 и О,О75 ч Таблица КоккобаМикроскопическоециллы 1,5 ДсМх исслеаование Х2,5 сМ Подвижность Грамм-реакция Образование розетки Рост на агаре NMS при вес. (об.) 0,1% метанола Рост на агаре NMs при вес. (об.) 0,5% глюковы Розовый/ Цвет колонии красный -S Тип мембрйнь и установки Тип 1 (диски) Рост при 37 с Рост при Усвоение элементарного азота. Образование пленки в статичной Ю1дкой культу-ре NWS + 5512 Q и С отношение, % По известной методике. Приведенные в табл. 1 данные убедительно свидетельствуют о том, что штамм Ni 11221 можно классифицировать как штамм бактерий Met tomonas rt eitiaT ca. Однако штамм № 11221 отличается от (шисаиия всех известных штаммов М. tnCitionACa по своей способности усваивать элементарный азот в качестве источника азота. В табл. 2 представлены характеристики гетеротропных бактерий, штаммов F2qVObc3Ct.rium НКПБ № 11229 И PseodOTTtotias maetoprii ia НКПБ № 1123О, выделенных из ферментера при скорости разбавпе1шя О,О75 ч

Микроскопические исспе-Папочки O,7

дованияX 3-5 М

Морфология колонии иЖепто-ораиж

размер после ч инку-непрозрачная бирования на NAния днамагро

3 мм

Грам-штаммПодвижность и обраэова-иие жгутиков

Анаэробный рост на NA

Рост на агаре , содержащем О,1 вес.%/об)

метанолаТест на оксидазу,

Тест на каталазу+

Тест на уреаэу (по

Христенсену)«

Рост в среде KCN

(Мюллер).- .

Разжихсение желатина+

Восстановление нитрата. Усвоение питрата (Коэерс) - Усвоение МапонатаЦТ Тест МР Тест VP

Индольный тест (реагент

Ковака)Hrj S из вептова вода Рост в пвото1ПяЫ1 водно сахарной сре

Глюкоза

СахарозаЛактозаПапочки О,5;,МХ X 5JU.W

Беловатая бесцветная колония диаметрам 1 мм

Отдельные жгутики

римечание: Все тестовые испытания проводили при инкубировании при , + -. попожитепьная реакция; - - отрицательная реакция; V - переменная; NT - не определяли; NA - питательный агар; среда нитратных минеральных солей Пример 2. 4,5 л водной питательной среды состава, указанного в при мере 1, помешают в фер 1еитер емкое тыо 7 я. Ферментер снабжен импеллером для перемешивания бульона и приспособлениями для аэрации и подачи метана в бульон. Среду перемшиивают пря им пеллера 1ООО об/мин, нагревают до 30°С, и далее поддерживают эту температуру, рН среды устанавливают 6,7 и поодерживают далее на этом уровне, добавляя 2 н. КаОН с помощью автрматическмО приспособления для титрования. Затем в ферментер засевают 500 мл ино кутшта, полученного в соответствии со спедуюшей методикой. В 5 колб, каждая из которых содержала по 1ОО мл сте,рильной жидкой среды ММ ннокулнруют по одной полной петле смесью куль. тур, как н в примере 1, на выращенной поверхности МС скошенного агара. Каждую из колб закрывают пробкой Сабасвя, вводят газовую смесь, состоящую из 2О% метана по объему в воздухе, и инкубируют на роторном вибрхютенде при ЗО°С в течение 4 дн. Сразу после инокулирования среда слегка помутнела. Метан подают в ферментер со скоростью 75 л, ч/15 об/об/ч, а воэ-, дух - со скоростью, меньшей 1 л/ч, так что концентрация кислорода, растворенного в среде, в соответствии с данными пробы на растворенный кислород, не превышала 2О% от насыщающего воздуха. Культивирование проводят нестерильно, исполь; уя условия периодического процесса. Спустя 24 ч плотность микробных клеток стала слегка возрастать, а концентрация растворенного кислорода начала падать. На этой стадии скорость подачи воздуха увеличивается до 30 л/ч/ /6 об/об/ч. Спустя еше 8 ч скорость импеллера увеличивают до 150О об/мин и начинают непрерывный процесс, вводя минеральную водную среду, состав которой приводится ниже, в ферментер со скоростью 150 мл/ч и выводя из ферментера б ульон с такой же скоростью, для nodaepжания постоянного рабочего объема 5 я (достигнутая скорость раабавленяя соо таввпа О.ОЗ ): НзР04 1600 мг Н«1$04 64 мг HHOj 6208 мг K(jS04 448 мг 848 мг Ca(NO:,)« 4HnO 32О мг Cu504. 25 мг FeSO47H(ip 38 мг Z.nSO47H,0 14.5 мг MnS04Hrjp 2,5 мг Со(КОзК-6Н(О 2,3 мг NafiMo042HiiO 7,0мг N ceii-6HQp 0,2 мг 3,0 мг Дистиппированная До 1 я После спедуювшх 60 ч непрерывно го процесса скорость поаачн воэяуха по степенно повышают до 22О п/ч/44 об/ /об/ч, а скорость подачи метана постепенно уменьшают до 4О11/Ч/8/об/ч/, а скорость импеллера повышают до 2ООО об/мин. рН устанавливают и по держнвают на уровне 6,7 аа счет добзд пения 2 н. гидроокиси натрия, а TeMiieратуру поддерживают . В «тих усло виях культивирование происходило в устайовившемся режиме. Бульон вяз.кий и цвет его роэово к{ асны«. Смола прсшупкруется со сянфостью ОД г/а/ч а микробная биомасса - со скоростыо 0,27 г/л ч у & ре льтате чего полную прсюэводвтепьносп. биополимера в биомассы О,37 г/л ч. Бульон вз ферментера собврают и по дают в центрифугу, реЕботаюшую с высокой скоростью до 250ООЯ5.Центри4чгг«руют бульон со ск фостью 2500O j течение 3 ч. Получают прозрачцук кую жидкость, содержшоую гетерсяюпис 74 харидный биопот{мер и розово-красный осадок микробной биомассы, содержащий некоторое количество биополимера. Анапиз популяции микробов, присутствующих в бульоне при установиинемся режиме культуры, показывает, что она состоит из около 80% по числу клеток микроорганизма, усваивающего метан в образующего биополимер Welt ieotnona8 mrttiqniM НКПБ № 11221 и 20% по чиопу кпеток смеси гетеротрсжных бактерий. Около 50% от чисаа гетеротрофных бактерий, как было опредепено, составпяяя малоподвижные аэробные грамотрицатёльные .палочки peavobactftPAuw stFqvn НПКБ № 11256. Около ЗО% от чиояа этих бактерий составлял штамм РЕа ЮЪ |сterium strain НКПБ N 11229, описанный в примере 1, и около 5% от числа быяи подвижные аэробные грамот жцатепьные палочки FJavotoacter om StroVn НКПБ № 11258. Остальные, примерно 15% от чиспа составляющих смесь бактерий, а именно штамкл ffavobatt rtuw ,Р5еиаошъсх5 mQгiop vtia и Pstudomonas maetopn Cioi под номерами НКПБ 11254, 11255 и 11257 соответственно. Очень небольшое количество других гетеротропных бактерий также присутетв)вапо, однако их ие выдегегли дия целей идентификации. Дан1а 1е, подученные на осиовании различных диагностических тестов для штаммов бактерий, выдепенmiix из бульона, П1жведены в табл. 1-3. В табл. 3 представлены характеристики гетеротропных бактерий TltsvobdcterVum и Psev«3emonas tnaetofthftiq штаммов КПБ N. 11255, 11256, 11257 и 11258, выделенных вз ферментера .при аботе в установившемся режиме непреывного процесса, в условиях по примеу 2. Т а б л в ц а 3

Вид в KtHKpocKon

Морфология колонии и размер ее через 48 ч

на NA

Изогнутые Патючки

ПапочкиПалочки папочт

Грам-штамм

Подвижность и образование жгутиков

Анаэробный рост на Мс Тест на оксидазу (метод ппастинок)

Тест на катапазу

Разжижение желатина

Восстановпение нитрата

Усвоение нитрата (Козерс)

Усвоение мапоната

Тест МРТест VP

Индольный тест (реагент Ковака)HqS из Т53

1 спота из пурпурного

молока

Рост в пептоновой водн i сахарной среде:(глюкоза, сахароза,лактоза, маннитол, дупиитол)римем а ни е. Инкубирование проводит прв - положительная реакция;

отрицательная реакпия;

NT - не испытывали;

О - -нет роста;

ТЕ1 - тройной, сахарный ионный агар питательный агар.

Прн сопоставлении результатов примеров 1 и 2 видно, что при непрерывной культивировании при скорости разбавления как 0,03 ,так и 0,075 доминирующим микроорганизмом является ме- таниспользукяпий и образующий гетеропо2 полярных жгутика

+ + О О

+ + ц+ +

NT О .

NT О

О

NT

NT

О

о о о

лисахарйдный полимер штамм Methcteomonas n«iMn tq НКПБ № 11221 и одним из доминирующих гетеротропных бактерий штамм F2aNotacierioro strqin нкпБ № 11229. СЧзтальные гетеротропные бактерии в культуре могут меняться в зависимости от конкретных усповий ферментации, однако являются стабильными для конкретного набора усповий и выбраиы для усповий ферментации. Была проведена оценка сходства микробной биомассы с мясными продуктами в соответствии со следующей процедурой. 2 л бульона, описанного выше, подвергли центрифугированию при 33OOO J в течение 3 ч в высокоскоростной охлажденной центрифуге MSE-25 для получения твердой фракции, состоящей, главным образом, из микробных клеток с небольшим количеством гетеропописахарндного биополимера. Твердый продукт высушили cy6 пимационно с использованием серийного С5 12 сублиматора. Найдено, что сублимированный твердый продукт содержит около 95 вес.% биомассы и около 5% биополимера. 5 кг твердого продукта эапрессовали в виде темно-красной текс1ур рованной массы. Массу нарезали на 3мм кубики, суспендировали в дистиппированной воде и термообрабатывали под давлением в течение 15 мин. После охлаждения до комнатной температу{И оказалось что кубики сохранили рвою структуру,уве личившись в 2-3 раза в размерах. Струк турированные ломти имели вид кусков постного мяса. Охлажденные кубики оставались стабильными при интенсивном перемешивании.Гетерополисахаридный биополимер, полученный при ферментации, был выделен и охарактеризован в соответствии со сяе« дующей процедурой. 12л бульона, содержащего биомассу и биополимер, полученные в условиях установившегося режима непрермвиого выращивания культуры, как было описано в примере, разбавили 12 п воды и пропустили со скоростью 75 через центрифугу StiarpEes T:i ре 16 , работающую при 17ООО qf ,для удапеиия большей части биомассы (клеток бактерий). 11л надосадочной жидкости выделили после удаления биомассы и субисполы я сублиматор Seriot лимировапи, С 12.

Получили 25 г твердого гетерсшояисахаридного биополимера цвета буйволовой кожи. Этот образец обоэиа«юяи номером 1.

Сублимированный биополимер поместили в морскую воду, в результате чв го получили раствор 0,24 вес .%/об. Вязкость раствора измерили вискозиметром Брукфильда { UL приспособление)

Композиция 2.

Вторую композицию для бурового раствора получили с биополимером образца 1 в соогеетствии с композицией по npiMeру 1, только добавили гидроокиси натртя (0,5 г) для повышения рН до 9,9.

Вязкость раствора измеряли на вискозиметре FcmnV-S. Полученные данные приведены в табл. 6. и . Полученные при этом вязкосте характеристики приведены в таба. 4, Таблица 4 Вязкостные свойства биополимера 1 спытали затем в соответствии со слеующей процедурой в типичной композиии для бурения нефтяной скважины. Образец биополимера 1 введен в комозицию типичного (рового раствора. Композиция 1 Морская вода35О см Карбонат натрия2,5 г Бентонит5,0 г Хлористый калий35 г Декстрид3 г Карбоксиметипцеллюлоаа низкой вязкости (НВ-КМЦ) 2 г Биопопимер, образец 12,5 г Н раствора 9,3, Вязкость измеряли на искозиметре FannV-CS. Полученные при том данные приведены в табл. 5. . Таблица 5 Состав ажущаяся вязкость, сП 23 ластичная вязкость, сП 16 редел текучести, унт/1ОО кв. 19 Таблица Состав Кажущаяся вязкость, сП 23 21,5 Ппас-гачная вязкость, сП 16 15 Предел текучести, 4унт/кв, фут Полученные данные свидетельствуют о том, что этот биополимер является подходящим материалом для включения его в композиции буровых растворов для неф тяных скважин. Второй образец биополимера был выделен из бульона и его вязкостные характеристики оценены следующим образом. 6 л бульона центрифугировали при 33000 5 в течение 3 ч на высокоскоростной охлаждаемой центрифуге МЕ-25, 4 л надосадочной жидкости выделили пооле удаления биомассы и сконцентрировали до 1 л при пониженном давлении в роторном испарителе. К концентрату при интенсивном перемешивании добавляли 2 л изопропанола для осаждеиия полимера. бсажденный материал выделили из надосадочной жидкости путем центрифугирования, промыли водным изопропанол 4 (90% об./об.) и высушили в вакууме, в результате чего получили 7,5 г бело-коричневого порошка полимера, который обо значили как обрюзец 2. Порошок поместили в морскую воду, до получения 0,54% раствора полимера. Вязкость pacTBojML-OnP fl® ™ вискозимет ром Брукфильда (UU приспособление) при . Характеристики вязкости при ведены в табл. 7.

Т а б-л и ц а

7,6

26,5 23,6 6,6 5,6 19,4 4,0 Зашкалило 92

Эти данные демонстрируют обратимост вязкостных характеристик сдвига водного раствора полимера.

С помощью поляриметра Хильгера было измерено оптическое вращение некоторотч) количества образца 5. Величина удельного вращения составила -26

Определение молекулярного веса провели для образца 6, используя известную методику гельпроникающей хроматогра( и хр {атограф Устерса QPC/A L С-244, снабженный пятью колонками (2 фута х хЗ/4 дюйма; 60,96 см х 19,О5мм), соединенными последовательно и набитыми пористым стеклом с диаметрами пор 4 Следующий образец (образец П) полимера выделили из бульона и его характеристики сдвига определили в водном растворе следующим образом. 1,2 л бульона центрифугирювания при ЗЗООО у в течение 2,5 ч в высокоскоростной охлаждаемой центрифуге ME к 1300 см 3 надосадочной жидкости сконцентрировали в 10 раз и сублимировали в сублиматоре Seria«.C51l. Часть субпимированного биопопимера растворипи в морской воде (0,4 вес.%/об,) и вязкость измерили реогониометром Вайсенберга. Пример 3. Следующие образцы биополимера были выделены из бульона, полученного в соответствии с методикой, описанной в примере 2. Эти образцы были помечены номерами 4-6. HeitOTOpoe количество образца 4 -поместили в морскую воду для попучения 0,75% раствора вес./об. Затем вязкость раствора измерили для ряда увеличивающихся и уменьшающихся скоростей сдвига на вискозиметре Нааче RotoS/isco , используя стандартные системы Ьо1э Сир, Полученные данные приведены в табтив. Таблица 8

20ОО, 1250, 7ОО, 24О и 75 А соответственно. Установку калибровали, испопьзуя стандартные фракции Декстрена. Было найдено, что полимер состоит из двух осйовных фракций г-етерополисахарида со средним молекулярным весом около 110) 10 и 2 -Ю соответственно.

Пример 4. 6 образцов гетерополисахаридного попимера выделили из ферментационного бупьона и приготовили в соответствии с методикой примера 2. Содержание сахарида бы.ло проанализировано следующим образом.

Образцы подвергли гидролизу при 100 С в течение 20 ч в 1 и. серной кислоте. Гидропизат нейтрализовали гидИз табл. 9 видно, что один из образцов существенно отличается по своему составу относительно содержания фуккоэы и маннозы по сравнению с остальными 5 образцами. Достоверные пределы для ко1Ь1чества сахаридов установлены не л Пример 6. Этот пример иллюстр руег 2-стадийную ферментационную систему, вызывающую выход гетерополисахарид ного биополимера. На первой стадии 6,0 л ферментациовного бульона, полученного в соответствии с методикой, описанной в примере 2, поместили в ферментер, полная емкость которого 7 л. Бульон содержал приблизительно 8О% от числа клеток Mettiijeonioncis mei1:ianicci НКПБ № 11221 и прибли зительно 2О% от числа клеток смеси гетеротропных бактерий. Полная концентрация клеток в бульоне составила около 9 г на литр (в расчете на сухой вес). Ферментер был снабжен импеллером и приспособлениями для подачи воздуха и метана в бульон. Бульон перемешивали со скоростью импеллера 1000 об/мин,нагрева ли и поддерживали температуру около . рН доводили до 6,4 и поддерживали, испопьзуя 2,0 н. раствор гидроокиси натрия.

роокисью бария, выпавший в осшок сульфат бария удалили пентрифугированием. Основные сахариды, присутствующие в гидролизате, были идентифицированы с по мошью газовой хроматографии и массспектрометрии их пераиетилпроизводных в виде глюкозы, фуккозы, маннозы н галактозы. С помощью тонкослойной хроматографии было, показано наличие уроновой кислоты. Конфигурацию связей не определяли, однако есть основания npefuionaiгать, что это, главным образам, (Ь -ков фигурация,

КоличествеиньЛ аналиэ сахаридов и уроновой кислоты, присутствующих в образце,, приведен в табл. 9.

Таблица 9 который добавляли с псжющью автоматического рН контроллера. Метан подавали в бульон со скоростью 4О п/ч, а воздух - со скоростью меньше 10 и 1ОО л/ч« так что концентрация растворенного в бульоне кислорода, как определялось с помощью пробы на растворенный кислород (UH foc ineeTinqf Cotnpan s) не превышала 1О% от насыщенного воздуха. Водная минеральная среда подавалсь в бупьон со скоростью 6ОО мл/ч, а бульон отводи шс из ферментера с аналогичной скоростью для поддержания постоянного рабочего объема 6,0 л. Это определило скорость разбавлеиия О,1 час Композиция водной питательной среды была следующей: 8OO МГ 34 МГ 3OOO МГ 191 МГ 426 МГ MQfS047Hi2.0 CaCei2(AnYii6lroos) 75 МГ 12,6 МГ CuSOASHfjp 19,O МГ 7H(iP 7,3 МГ 1ПЭ04 7H(2p 1,2 МГ 1,0 МГ Cx)C5 0.- 6HoP NatjMoO- ,4мг Дистилпированная водаДо 1 п. Псюпе первых 24 ч непрерывного куль тивирования скоррсть подачи воздуха постепенно увеличивают до 22О л/ч, поддерживая уровень растворенного кислороAia в бульоне ниже 10% от насыщающего воздуха. Спустя 5 дн, в таких условиях гстановипся режим нестерильного непрерывного процесса. Бульон, получаемый из этого ферментера; отличался малой В51зкостью и РОЗОВЫМкрасным цветом. Бульон центрифугировали в течение 2 ч. Анализ иадосадочной жидкости показал, что в ней содержится полная концентрация карбогидрата (антронный способ) 4О мг/л« Затем этот бульон подавали в ферментер водной стадии, в котором его подвергали следующим условиям куль тивирования в периодическом процессе. 15л водной питательной среды, состав которой приведен ниже, мг: HaSO4 22 HNO J20ОО KI OA150 М(04- THtjpi284 CaCCiSO CuSO. SHrjp8,4 FeS04 .7HQ.O13,O InsO4-7H(lO5,0 MnS04- бНгОо,8 Сосг 6HijO0,7 NaMoO- 2HQp2,3 поместили в ферментер ломкостью ЗО о. Этот ферментер снабжен импе1шером и приспособлениями для подачи метана и воздуха. Среду такого состава перемеши вали при скорости импелпера ЮООоб/м и нагрели до . рН среды поддержив ли при 6,0 используя 2,0 и. гидро Я1н.ся натрия. 5 л бульона культурл из первой стадии непрерывного процесса ферментации, описанного выше, добавили к этой среде в ферментере. Воздух подавали со скоростью 25 л/мин, а метан - со скоростью 6 л/мин. импеллера по держивали при 1ООО об/ми |рН среды вз мераАи, но не изменяли. Емэльше в фе1 ментер ничего не добавляли. В таком периодическом культивароваtam начальная плотность клеток составля ла 3 г/л (в расчете на сухой вес). Пло вость клеток составляла 11 г/л спустя 22 ч и оставалась такой до окончания феркюнтааии спустя 46 ч. Котшчество нитрата, присутствующего В бульоне, измерялось через некоторыо промежутки времени. Через 22 ч нитрата вовсе не обнаружипи. Рост был ограничен за счет ограничения источника азота. Ферментацию продолжали в течение 46 ч в нестерильных усповиях, причем за это время вязкость бульона очень повысилась. Вязкость измеряли с помощью вискозиметра Брукфильда, модель LNP снабженную балансиром № 3, поворачивающимся со скоростью 6 об/мин. Начальная вязкость немедленно после инокуляции была слишком низка, чтобы ее можно быпо измерить вискозиметрюм, настроенным как бы по описано выше, однако спустя 22 ч вязкость уже была 4 900 сП пауз, а спустя 46 ч значение вязкости поднялось, до 107ОО сП. Полное содержание сахарида в надосадочной жидкости после центрифугирования бульона составляло 1550 мг/л спустя 22 ч н 22ОО мг/л спустя 46 ч. Это указывает, что возрастание вязкости связано с присутствием воднорастворенного экстраиеллюлярного полисахарида. В конце второй стадин ферментации (т.е. спустя 46 ч) бульон пастеризовали, прекращая подачу в бульон метана и воздуха и быстро повышая температуру от ЗО до 6О С. Спустя 1О мнн бульон быстро охлаждали до ЗСЯС. Полимер выделяли из охлажденного бульона следующим способом. 16 л термообработанного и охлажденного бульона раабавили 4 объемами дистиллированной воды и центрифугировали в суперцентрифуге непрерывного действия SVarpEes (модель 1Q). используя скорость потока ВО см /мин. 6О л центрифугированной надосадоч.ной жидкости переместили в сосуд из нержавеющей стали и практически свободные от клеток полисахариды осадили, добавляя хлористый калий до получения 2 вес.% об. растворе и 12О л метанола. Осажденный материал выделили центрифугированием ( LaVQl 1О2-В-25 центрифуга) и снова растворили в 2 л дистиллированной воды. Продукт повторно осадили добавтюнием такого котгачества хлористого калия, которое потребовалось для получения 2% раствора (вес. . об.} и 4 л метанола. Полимер выделили центрифугированием, дважды дегидрировали двумя литрами метанола и выделили фильтрованием. Полимер высушивали на воздухе и измельчали в молотковой мельнице, в результате чего получили свободно пересыпа loщийся порошок цвета буйволовой кожи. Эпемеитарный анализ попимера; впага 14,0 вес.%; С 45,5; Н 5,4j N3,3 эоиа 6,7. Dsi3KocTb одя(я1ропентного раствора в дистиллированной воде измеряют по вискоаиметиг Ferranti shirEes Она составляет 268 сП при скорости рдвига 1ОО с- и 58 сП при 1ООО сг1. Таким образом,, попеченные продукты можно использовать в качестве цолаклеркого модификатора или загушакмоего ида суспендирующего агента в широком интер вале ве риаитов пр{ме кення, например, для получения композиций Яровых расгворов, компоанций для добьпш кефпги, стабипизаторов дму||| а(й, жидких paa6aiBHire лей лекарственнь х nf apeiTOB и эагуо THfeneBfl или суслё здвруюшях преявратоЬ при изготовлении пищевых ияи косметических продуктов, а также крассж. о р м у л а и а о б р е т е н к « Способ получения биомассы микроорг гашзмов, прещгсматгяйвакжшй ку1а тиви- рбванне в аэробных усяэвиях в присутст|вии газообразного метана на жядтой яитаI тельной среде, содержащей источники азбта в минеральные соли, метениспользуктего 9 4 кшкроорганизма Mettn fornoT as В присутствия метанолиспользу1ошего микрооргани MaPseoaomoncis с поспедукяиим выделением микробной биомассы из культурапьноЙ жидкости, отя и чающийся тем что, с целью получения наряду с биомассой и гетерополисахаридного С Я1О1Шмерв и увеличения таким путем выхода оепевого продукта, в качестве метаниспоге зук шего микроорганизма используют штамм HieiWtomonaE mettiamcq НКПБ № 11221, образующий гетерополисахаридный бнопси яимер, а в качестве метанолиспользую- щего микроорганизма используют штаммы Pseudomonas mqgtophvEi a НКПБ № 11230 H/Kiw-Pseu46wom5 mciCtopli eia НКПБ № 11255, и/ида PeeufiOTOOT QS wtQCtopWe a НКПБ № 11257, M/HnBF«aMobacteHom НКПБ № 11254, B/«iwFeavobacteriom НКПБ М 11256, а/или ftovobactfcpium НКПБ № 11258, и/или FeavobocteHum stroin НКПБ № 11229, при этом для выделения гетерсн мгасахаридного биополимера из культуральной жидкости п следнюю нагревают до 5О-9ОС, Источники ннформапии, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент СССР № 61587О, кл. С 120 13/О6, опублик. 1979.