Способ получения калликреинтрипсин-ингибитора Советский патент 1976 года по МПК C07K14/78 C07K14/47 

Наряду с чистой водой применяют и 0,01 М соляную кислоту и затем 0,02 М раствор натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты. При этом удаляют примеси. Вымывание ингибитора из смолы осуществляют органическими, смешиваемыми с водой растворителями, например метанолом, этанолом, изопропанолом, ацетоном.

Концентрация, при которой вымывают каллЕкреин-трипсин-ингибитор, зависит от вида растворителя. Добавки к растворителю могут изменить процесс десорбции. Так, например, добавка аммиака содействует ускорению вымывания, причем вымываются и красящие компоненты. Полученный таким образом калликреин-трипсин-ингибитор как показал электрофорез в полиакриламиде или на ацетилцеллюлозе, в значительной степени свободен от других сопутствующих полипептидов и солей. Специфическая активность составляет 3000-4000 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг сухого веса. Выход составляет 60-80% содержания ингибитора сырого экстракта при обогащении в 30-40 раз.

Пример 1. 700 г легкого крупного рогатого скота, освобожденного от соединительной ткани и измельченного, переводят в растворимую форму метанолом при добавке хлорида кальция. Суспензию отделяют центрифугированием и в вакууме в ротационном испарителе сгущают до 275 мл. Метанол полностью удаляют. Значение рН раствора 1,5 устанавливают, добавляя 2 н. соляную кислоту, затем снова центрифугируют. Отделившийся сверху слой содержит 880000 единиц калликреин-ингибитора. Этот раствор вводят в следующую колонну.

50 г пористой полистирольной смолы с поверхностью 330 поглощают в метаноле и до тех пор промывают, пока метанол не станет практически свободен от адсорбируемых при ультрафиолетовом облучении (280 нм) веществ. Затем метанол декантируют и заменяют кипяченой дистиллированной водой. Водную суспензию смолы (примерно 100 мл), свободную от пузырей, вводят в стеклянную колонну и промывают 200 мл воды.

Содержащий ингибитор сырой экстракт вводят в колонну с пропускной скоростью 100 мл/ч, промывают 200 мл 0,01 М соляной кислоты и затем 200 мл натриевой соли 0,02 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 100мл воды. Ингибитор при этом с линейным градиентом 1 л воды к 80% метанола вымывают и фракционированно улавливают. Содержащую ингибитор фракцию объединяют, метанол выпаривают в вакууме и водный раствор подвергают сублимационной сушке. Получают 180 мг ингибитора с 714 единицами калликреи 1-ингибитора, что составляет 81 % содержания ингибитора. Специфическая активность составляет 3960 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг.

Пример 2. 4 кг измельченного легкого крупного рогатого скота смеп1ивают с 7,2 л

дистиллированной воды. По истечении 10 мин размешивания добавляют 350 мл 10%-ной (по объему) H2SO4 до установления значения рН 1,9. Дополняют до 12л, дополняют 200 мл толуола и размешивают в течение ночи при комнатной температуре. Суспепзию центрифугируют в течение 10 мин при 4800 об/мин. Общая активность в отстоявшемся наверху слое 8,15X10 единиц калликреин-ингибитора.

Размешивая в течение 30 мин, добавляют (ЫП4)250.1 до насыщения 0,45. Значение рП посредством добавки концентрированной H2SO4 устанавливают на 1,5, в качестве фильтровального вспомогательного вещества добавляют 320 г кизельгура и немедленно фильтруют.

7 л этого раствора (общая активность 4,38X10 единиц) калликреин-ингибитора вводят в колонну примерно с 2 л пористой

полистирольной смолы с поверхностью 150 . Перед этим кислоту промывают 1 н. метанольным НС1, метанолом и водой. После введения экстракта колонну промывают 4 л 0,01 н. ПС1, 4 л 0,02 ЕДТА (натриевая соль

этилендиаминотетрауксусной кислоты) и 2 л дистиллированной воды, затем вымывают линеарным градиентом, состояющим из 5 л дистиллированной воды и 5л 80%-ного метанола. Активные фракции объединяют, метаНОЛ отгоняют в вакууме и раствор лиофилизируют. Получают 1,3 г вещества со специфической активностью 2500 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг (общая активность 3,22X10 единиц калликреин-ингибитора),

что соответствуетВЫХОДУ 73,5%.

Пример 3. 120 кг легкого крупного рогатого скота метанолом при добавке хлорида кальция согласно примеру 1 переводят в растворимую форму. Из 400 л полученного прозрачного фильтрата метанол тщательно отгоняют. Водный раствор, содержащий калликреин-трипсин-илгибитор в сыром виде, подкисляют НС1 до значения рП 1,5 и вводят в колонну с 8 л пористой полистирольной смолы

с поверхностью 150 . Общая активность 152X10 единиц калликреин-ингибитора. Колонну промывают 16 л 0,01 н. ПС1, 16 л 0,02 М ЕДТА и 10 л дистиллированной воды. Затем активное вещество вымывают линеарным градиентом из 20 л дистиллированной воды и 20 л 80%-ного метанола. Фракции, содержаHuie активное вещество, объединяют, метанол отгоняют и раствор лиофилизируют. Получают 25,7 г твердого вещества со специфической активностью 4200 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг (общая активность единиц калликреин-ингибитора), что соответствует выходу 71 %. Пример 4. 120 л легкого крупного рогатого скота, переведенного согласно примеру 1 с метанолом-хлоридом кальция в растворимую форму, после удаления метанола, установления значения рН 1,5 и центрифугирования дали 67 мл отделившегося сверху слоя с

150000 единицами калликреин-ингибитора. В

этот сырой раствор ингибитора вводят 10 мл пористой полистирольной смолы. После 30 мин на нутч-фильтре смолу отсасывают и промывают 100 мл воды. Затем смолу суспендируют и в течение 30 мин размешивают в растворе 20 мл изопропанола, дополненного водой до 100 мл. Смолу отсасывают и в фильтрате после отгонки изопропанола в вакууме определяют ингибитор. Выход 123 единиц калликреин-ингибитора, что составляет 80% имевшегося содержания ингибитора.

Формула изобретения

Сгюсоб получения калликреин-трипсин-ингибитора путем селективного выделения из

сырого экстракта органов крупного рогатого скота, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, экстракт подкисляют до рН 1,0-3,0, вводят в него соли, например сульфат аммония, в концентрации 1-400 г/л, подвергают контакту с нейтральным нерастворимым в воде сшитым полимером пористой структуры из стирола и дивинилбензола с активной поверхностью 10-1000 м-/г, последовательно промывают полимер водой или разбавленной соляной кислотой и раствором соли этилепдиаминотетрауксусной кислоты, элюируют целевой продукт градиентом воды и смешивающегося с водой органического растворителя.