СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВНОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ ИЗ ОРГАНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 1998 года по МПК C07K1/18 C07K1/36 C07K14/81 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения основного ингибитора протеиназ (типа Кунитца) из органов крупного рогатого скота, и может быть использовано в медицинской промышленности для приготовления лекарственных препаратов, используемых для лечения заболеваний, связанных с дисбалансом систем протеолиза организма.

Ближайшим техническим решением является способ получения основного ингибитора протеиназ, заключающийся в том, что его адсорбируют из растворов на амфотерном ионообменнике на основе полистирола, содержащем аминоуксусную или иминоуксусную группу, с последующим удалением неадсорбировавшихся веществ путем промывки буферным или солевым раствором и десорбции ингибитора с помощью создания солевого градиента.

Недостатком указанного способа является использование уже предварительно очищенных (2000-4000 KIE/мг белка) и высококонцентрированных растворов (5100-7800 KIE/мл) основного ингибитора протеиназ с очень низким содержанием солей (проводимость 0,12 mS), что достигается их предварительным концентрированием и обессоливанием. Удельная активность продукта при этом возрастает в 1,23-3,1 раза.

Ожидаемый технический результат от предлагаемого способа состоит в том, что выделение основного ингибитора протеиназ можно проводить из более широкого круга растворов: из экстрактов, выделенных непосредственно из органов крупного рогатого скота, бедных по содержанию ингибитора и обладающих его низкой удельной активностью; из очищенных и неочищенных растворов с проводимостью до 6 mS; из растворов, содержащих органические растворители.

Предлагаемый способ получения основного ингибитора протеиназ заключается в том, что его неочищенные растворы получают из органов крупного рогатого скота измельчением, экстракцией, отделением жмыха, удалением белков и липидов, далее адсорбцию ингибитора ведут при рН 7,0-10,5 из растворов с проводимостью 6 mS на катионообменнике с карбоксильными группами и десорбируют целевой продукт раствором соли при рН 1-13 и его выделяют известными приемами.

В качестве карбоксильных катионообменников наиболее пригодны современные макропористые полиакриловые, которые устойчивы в широком диапазоне рН, обладают хорошими гидродинамическими свойствами в кислых и щелочных условиях, имеют высокие избирательность и емкость по отношению к основному ингибитору протеиназ.

Существенными отличительными признаками изобретения являются использование неочищенных растворов, которые получают из органов крупного рогатого скота измельчением, экстракцией, отделением жмыха, удалением белков и липидов, адсорбцию ингибитора ведут на макропористых полиакриловых катионообменниках с карбоксильными группами при рН 7-10,5 из растворов с проводимостью не более 6 mS с последующей десорбцией целевого продукта раствором соли при рН 1-13 и его выделением известными приемами.

Удельная активность основного ингибитора протеиназ, выделяемого по предлагаемому способу, возрастает в 50 -150 раз.

Пример 1. 1 кг замороженной поджелудочной железы крупного рогатого скота измельчают на мясорубке и проводят экстракцию в течение 2 ч 3 л 65%-ного раствором этилового спирта при рН 4,0, которое поддерживается с помощью фосфорной кислоты. После отделения жмыха экстракт подвергают вакуумной дистилляции до содержания этанола 20% Слой липидов, образующийся при охлаждении до 5^oC, отделяют фильтрованием. С помощью гидрооксида кальция устанавливают рН 7,0 и через 2 ч раствор фильтруют. Полученный раствор, обладающий проводимостью 2mS и содержанием ингибитора 321 KIE/мл (29 KIE/мг белка), пропускают через катионит Bio-Rex 70 (Bio-Rad, США), помещенный в колонну 1,5х8,0 см. Целевой продукт элюируют раствором хлористого натрия с рН 7,0. Фракции, содержащие активный белок, объединяют. Удельная активность основного ингибитора протеиназ при хроматографической очистке на карбоксильном катионите возрастает в 70 раз и составляет 2030 KIE/мг белка.

К объединенному раствору прибавляют хлористый натрий до его концентрации 200 г/л и перемешивают до полного растворения соли. Через 12 ч осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 15 мл раствора соляной кислоты с рН 1,7, наносят на колонку с сефадексом G-50f (1,5х50 см) и ведут хроматографию в растворе соляной кислоты с рН 1,7. Фракции основного ингибитора протеиназ, очищенные от высокомолекулярных белков, объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации. При 5 ^oC осаждают ингибитор шестью объемами ацетона, выдерживают 12 ч, осадок отделяют центрифугированием и сушат при 20^oC до постоянной массы. Получают 12 мг апирогенного порошка основного ингибитора протеиназ с активностью 5000 КIЕ/мг, пригодного для приготовления лекарственных форм.

Пример 2. 1 кг замороженных легких измельчают и экстрагируют 2 ч 5 л раствора фосфорной кислоты с рН 4,0. Отделяют легочную ткань центрифугированием и экстракт нагревают до 70^oC, а затем охлаждают. После доведения рН до значения 5,6 раствором 20%-ного гидроксида натрия дают раствору отстояться, и отделяют выпавший осадок фильтрованием. В супернатанте с помощью раствора гидроксида натрия устанавливают рН 9,5, при этом проводимость раствора составила 6 mS, а удельная активность 33 KIE/мг. Полученный раствор пропускают через карбоксильный катионит Биокарб-т (Биохимреактив, Латвия), помещенный в колонну 1,5х8,0 см. Элюцию основного ингибитора протеиназ проводят 1 М раствором хлористого натрия с рН 12,5. Удельная активность объединенной фракции, содержащей ингибитор, при хроматографической очистке возрастает в 75 раз по сравнению с исходным раствором и составляет 2475 KIE/мг белка. К объединенному раствору прибавляют хлористый натрий до его концентрации 250 г/л, перемешивают до полного растворения соли. Через 12 ч выпавший осадок отделяют центрифугированием.

Осадок основного ингибитора протеиназ растворяют в 20 мл 0,05 М раствора аммония углекислого кислого. Проводят хроматографию на сефадексе G-50f (2,5х50 см) в растворе 0,05 М аммония углекислого кислого. На выходе с колонны фракции, содержащие ингибитор, объединяют и подвергают лиофильной сушке. Получают 100 мг белого апирогенного порошка основного ингибитора протеиназ с активностью 5100 KIE/мг, пригодного для приготовления лекарственных форм.

Примеры 3-9. 1 кг органов крупного рогатого скота, содержащих основной ингибитор протеиназ, измельчают на мясорубке, экстрагируют 5 л раствора, поддерживая с помощью серной кислоты рН 3,0. Жмых органов отделяют фильтрованием. С помощью 20%-ного раствора натрия гидроокиси устанавливают рН 7,0 и выпавший осадок отделяют центрифугированием. К прозрачному экстракту прибавляют хлористый натрий до его концентрации 250 г/л. После растворения соли раствор выдерживают 12 ч и выпавший осадок отделяют центрифугированием. Белковый осадок растворяют в 100-500 мл дистиллированной воды до достижения проводимости 3 mS и устанавливают рН 7-10,5. К полученному раствору прибавляют 15 мл катионита Amberlit IRC-50 (R H, США), уравновешенного при том же значении рН. Раствор перемешивают 1 ч и отделяют носитель фильтрованием. Элюцию ведут 1 М раствором хлористого натрия с рН 9-11,5 и объединяют фракции, содержащие активное вещество.

К раствору, полученному при элюции, прибавляют сульфат аммония до его концентрации 550 г/л и перемешивают до полного растворения соли. Через 10 ч осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 10 мл 5-ного раствора уксусной кислоты. Проводят хроматографию на гидрофильном геле ЭД-5,0 (1,5х50 см) в растворе 5% -ной уксусной кислоты. Фракции ингибитора объединяют, подвергают стерилизующей фильтрации и лиофильной сушке. Получают апирогенный белый порошок основного ингибитора протеиназ.

Результаты проведения хроматографической очистки и характеристика конечного продукта сведены в таблице.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения основного ингибитора протеиназ из органов крупного рогатого скота. Технический результат от применения изобретения состоит в выделении основного ингибитора протеиназ медицинского назначения из широкого круга растворов: экстрактов органов, неочищенных растворов, содержащих высокие концентрации солей. Предлагаемый способ получения основного ингибитора протеиназ заключается в том, что неочищенные растворы получают из органов крупного рогатого скота измельчением, экстракцией, отделением жмыха, удалением белков и липидов, а адсорбцию ведут на макропористом полиакриловом катионообменнике с карбоксильными группами при рН 7-10,5 из растворов с проводимостью не более 6 mS с последующей десорбцией целевого продукта раствором соли при рН 1-13 и его выделением известными приемами. 1 табл.

Способ получения основного ингибитора протеиназ адсорбцией его из растворов с последующей десорбцией, отличающийся тем, что используют неочищенные растворы основного ингибитора протеиназ, которые получают из органов крупного рогатого скота путем измельчения сырья, экстракции, отделения жмыха, удаления белков и липидов, а адсорбцию ведут на макропористых полиакриловых катионообменниках с карбоксильными группами при pH 7 10,5 из растворов с проводимостью не более 6 mS с последующей десорбцией целевого продукта раствором соли при pH 1 13 и его выделением известными приемами.