Способ выделения калликреинтрипсин-ингибитора Советский патент 1974 года по МПК C07G7/26 

1

Изобретение относится к улучшению способа выделения калликреинтрипсин-ингибитора.

Изгзсстен снособ выделения калликреинтрлпсин-ингибитора нутем его нрисоединения к нолимеру, предварительно связанному с тринсином. При этом удаление связанного калликреинтринсин-ингибитора и его обессоливание производят известными снособами.

Сложность этого метода заключается в необходи.мости предварительного связывания полимера с трипсином.

Согласно предлагае.мому изобретению способ выделения калликреинтрипсин-ингибитора из неочищенных растворов заключается в том, что неочищенный раствор калликреинтрипсинингибитора пронускают сквозь колонку, заполненную амфотерным ионообменником на основе полистирола, который обычно содержит аминоуксусные и(или) иминодиуксусные группы. При этом калликреинтринсин-ингибитор адсорбируется на ионообменнике, а неадсорбированное вещество вымывают буферным или солевым раствором. Последующее элюирование калликреинтрипсин-ингибитора обычно осуществляют нри концентрации хлористого натрия 0,25 моль и нри рН 6-10, нреимущественно 6,2-8. Обессоливание производят известными снособами.

Пример 1. Амфотерную ионообменную с.молу последовательно промывают 1 н. NaOH,

Дисгиллированной водой, 0,5 н. НС1 и Дистиллированной водой, 0,01М Na/К-фосфатным буфером со значением рН 8,0. 100 мл предварительно обработанной таким образом ионнообменной смолы вводят в колонку (2,5X20 см). Калликреинтрипсип-ингибитор, адсорбированный на кизельгуре, со степенью чистоты примерно 2000 единиц калликреинтрипсин-ингибитора на 1 мг экстрагируют водой. В этом )аство }с нутсм попеременного добавления ионообменников (форма Н+ и ОН) устанавливаютудельную теплопроводность 0,12м5Хсм-. 670 мл этого раствора с 5100 един1щами каллнкреинтрипсин-ингибитора/мл (общая активность 3,4 X Ю единиц калликреинтринсин-ингибптора) вводят в колонку, заполненную ионообменной смолой, со скоростью 1,15 мл/мин/см-. Колонку промывают 0,01 М фосфатным буфером и активное вещество элюируют с помощью 2 л 0,01 М фосфатного буфера со значением рН 8,0 и 1,0 М NaCl со скоростью 0,35 мл/мин/cм путем создания линейного солевого градиента. Активные фракции объединяют, обессоливают ионообменником и раствор подвергают лиофильной сушке. Выход составляет 87%, удельная активность 6030 ед калликреинтринсин-ингибитора/мг.

Пример 2. Амфотерный ионооб.менник готовят описанным в нр}1мере 1 способом и

уравновешивают 0,01 М Na/К-фосфатным буфером со значением рН 6,2 и 0,001 М этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЕДТА). 100 мл ионообменной смолы вводят в колонну (2,5 X 20 см). 20 мл предварительно очищенного раствора ингибитора активностью 110000 единиц к.алликреин-ингибитора/мл (общая активность 2,2 X 10. единиц калликреин-мнгибитора).и частотой 4000 единиц калликреин-ингибитора/мг вводят в колонну со скоростью 0,35 мл/мин/см. Колонку промывают 0,01 М фосфатным буфером и затем активное вещество элюируют с помощью 2 л 0,01 М фосфатного буфера со значением рН 6,2 и 0,01 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 2л 0,01 М фосфатного буфера со значением рН 6,2, 0,001 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 1,0 М NaCl нутем создания линейного солевого градиента.

Активные фракции объединяют, обессоливают ионообменниками и раствор лиофилизуют. Выход составляет 86%, удель 1ая активность 5000 единиц калликреин-ингибнтора/мг. Иммуноэлектроферрограмма показывает одну иолосу наряду с сопутствующим антигеном, в то время как исходный продукт показывает большое количество полос.

Пример 3. Амфотерную ионообменную смолу готовят аналогично примеру 1 и уравновешивают 0,01 М iNa-K-фосфатным буфером со значением рН 8,0 1300 мл сырого, но еще сильноокращенного раствора ингибитора с удельной активностью 7800 ед. калликреинингибитора/мл (общая активность 10,1 X Ю единиц калликреин-ингибнтора) со степенью чистоты 2400 единиц калликреин-ипгибитора.

мг с 100 мл ионообменника вводят со скоростью 0,35 мл/мин/см в колонну (2,5 X X 20 см). 11осле нромывки 0,01 М фосфатным буфером активное вещество вымывают, создавая линейный градиент NaCl в фосфатном буфере. Активные фракции объединяют, обессоливают ионообменниками и раствор лиофилизируют. Получают 1,58 г твердого вещества с удельной активностью 5500 единиц калликреин-ингибитора/мг (общая активность 8,68X10 единиц калликреин-ингибитора), что соответствует 86%. Полученный продукт оесцветен п совершенно свободен от иобочиых антигенов.

Предмет и з о б р е т е и и

я

1.Способ выделения калликреинтринсииингибитора из его неочищенных растворов, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, сырые растворы калликреинтринсин-ингибитора адсорбируют на амфотерной ионообменной смоле на основе полистирола с носледующим удалением неадсорбированны.х веществ путем промывки буферны.м раствором или солевым раствором, вымыванием калликреинтриисин-ннгибатора с помопдью создания солевого градиента и выделением целевого продукта известными приемами.

2.Способ по п. 1, о т л и ч а ю п; и и с я тем, что вымывание путем создания солевого градиента проводят при значении рП 6,0-10,0.

3.Способ по п. 1, о т л н ч а ю щ и и с я тем, что применяют ионообменные смолы на основе полистирола, содержащие радикалы аминоуксусной кислоты, нли радикалы и.минодиуксуепой кислоты, нли их смесь.