ВСЕСОЮЗНАЯ !i ^ . *;.,,г;.;л vrViiWMFf'K^--':I ilA \ till • tit-' 1 i.Anss"t.tRi-*n I bHb.fl^OTSHA Советский патент 1971 года по МПК C07K1/16 C07K1/14 

Известен способ выделения полипептидов, заключающийся в том, что нолипентид-(1) ковалентно связывается с растворимым или нерастворимым носителем и получающийся в результате этого аддукт приводится в воде в соприкосновение с раствором, содержащим полипептид, способный образовывать с полипептидом-(1) соответствующий комплекс, который очищают путем промывания или хроматографическим способом, переводят далее в диссоциированное состояние действием кйСлого буфера и затем элюируют целевой продукт.

Для выделения ингибиторов энзимов энзим, ннгибированый соответствующим ингибитором энзимов, ковалентно связывается с соответствующим носителем, получающееся нерастворимое в воде вещество вводится в соприкосновение с раствором ингибитора энзимов и образующийся комплекс очищается посредством промывания, переводится далее в диссоциированное состояние и затем отделяйтся ингибитор энзимов.

Применяющиеся в известном способе нерастворимые или растворимые носители представляют собой главным образом полимерные вещества, которые должпы содержать функциональные группы, способствующие в соответствии с методами химии пептидов протеканию химической реакции с выщеуказанными

нолипептидами, энзимами и ингибиторами пентидов. Среди вышеупомянутых полимерных продуктов в первую очередь следует указать такие макромолекулярные продукты, которые содержат в своем составе ангидридные, хлорангидридные, изоцианатные, а также азидные группы и, кроме того, такие смолы, которые содержат активированный атом фтора. Могут применяться также и известные, содержащие

в составе своих макромолекул карбоксильные группы, ионообменные смолы. В силу выщеуказанного обстоятельства большинство из приведенных продуктов обозначается как Л-смолы. При введении в выщеупомянутые

смолы групп основного характера получают так называемые полиаморфные смолы, в которых один отрицательный заряд смолы ослабляется до приблизительно нейтрального; такие смолы в последующем изложении будт обозначаться как N-смолы.

В результате исследований было найдено, что известный способ может быть в значительной степени улучщен, если в качестве носителя использовать N-смолу, так как они имеют

в больщинстве случаев значительно более высокую способность к связыванию, чем Л-смолы. При применении этих смол подлежащие выделению вещества могут быть изолированы при значительно более мягких условиях, каНИИ рН, чем в случае применения Л-смол. Кроме того, N-смолы связывают также энзимы и ингибиторы энзимов с гораздо более низким изоэлектрическим потенциалом, причем при аналогичном значении изоэлектрического потенциала Л-смолы или совсем не связывают вышеуказанные вещества, или связывают их только в незначительном кол)1честве. Так, например, N-калликреин-ингибигорная смола связывает калликреин, который совершенно не связывается А-калликреин-ингибиторной смолой, или смола на основе N-трипсина связывает ингибиторы, выделенные из соевых бобов, куриного белка, а также из сыворотки, которые с помощью смолы Л-трипсина или не связываются совсем, или связываются в очень незначительной .

N-смолы получаются в том случае, если система, состоящая из вещества-носителя и энзима или из вещества-носителя и ингибитора энзима, соответствующим образом совмещается с алифатическим или/и ароматическим (Юлиамином, у которого свободна только одна аминогруппа, а остальные аминогруппы защищены ацильными группами. В качестве аминов могут быть использованы, например, Н,М-диметилэтилендиамин, агматин, N-метилЫ-{3-аминапропил)-пиперазин, 4-аминопиридин, 2-аминопиридин, З-амино-1-циклогексиламинопропан и другие.

По предлагаемому способу получающиеся и фиксирующиеся на N-смоле комплексы в целях удаления сопутствующих веществ и загрязнений, присутствующих в составе препарата, основательно промываются водой и буферными растворами, после чего образовавшиеся комплексные соединения переводятся в диссоциированное состояние путем изменения рН реакционной смеси, и/или путем изменения концентрации ионов, и/или путем вытеснения с помощью конкурентноопособных и тормозящих соединений или субстратов для трипсина, таких, как, например, триптамин или н-бутиламин, и/или путем добавления таких продуктов, которые, как, например, мочевина и соли гуанидина, способствуют ослаблению или полному прекращению молекулярного обменного взаимодействия, что в соответствующих случаях производится путем обратимого денатурирования использующихся протеинов.

Среди энзимов, которые могут быть сконцентрированы из собственных в большей или меньшей степени загрязненных растворов; а затем очищены и выделены, в первую очередь следует отметить такие продукты, как, например, трипсин, химотрипсин, калликреин, плазмин, пепсин, ренин, рибонуклеаза, тромбин, амилаза, параин, гиалуронидаза, карбопепгидаза А и Б, панкреитопептидаза Е, пенициллиназа и холинэстераза.

Среди ингибиторов энзимов, которые могут быть очищены, сконцентрированы и выделены, используя предлагаемый способ, в первую очередь следует отметить обычные известные ингибиторы типа калликреинтрипсина (ингибитор Кунитца, тразилол R), специфические, например, оказывающие ингибирующее действие исключительно на трипсин, так называемые ингибиторы трипсина, получаемые из панкреатических желез свиней и крупного рогатого скота, из семенных пузырей и из семян растений и картофеля.

Помимо вышеуказанного предлагаемый способ концентрирования энзимов и их ингибиторов представляет возможность подыскивать новые ингибиторы для известных в настоящее время энзимов и, наоборот, подыскивать новые энзимы, которые могут быть ингибированы при использовании соответствующих ингнбиторов энзимов, в первом случае соответствующий энзим ковалентно связывается с веществом-носителем и после этого образовавщийся в результате аддукт обрабатыва. гся растворами, которые содержат соответствующие ингибиторы для подвергающегося обработке энзима, в течение такого промежутка времени, пока не уменьшится биологическая активность данного энзима. В последнем случае процесс осуществляют аналогичным

образом, но в обратной последовательности. Преимуществом предлагаемого способа концентрирования энзимов и их ингибиторов является возможность обрабатывать также и такие полипептиды, энзимы и их ингибиторы,

концентрирование которых из их загрязненных растворов ранее было связано с серьезными затруднениями, а в некоторых случаях было просто невозможно, причем указанное концентрирование, последующая очистка и

выделение производятся очень простым способом с хорощими выходами и степенью чистоты.

Пример 1. Получение водонерастворимой смолы N-трипсина.

200 мг смолы ЕМА-31 фирмы Монсанто добавляют при перемешивании к охлажденной до О-4°С смеси, состоящей из 20 мл 0,1 о/о-него гексаметилилендиамина и 75 мл солянобуферного раствора (0,1 М триэтаноламииа,

0,1 М поваренной соли) с рН 7,8. Полученную суспензию гомогенизируют в течение непродолжительного времени, перемешивают и через 2 мин после добавления смолы совмещают с охлажденным до О-4°С раствором 1 г

трипсина в 75 мл соляно-буферного раствора. По истечении 4 мин медленного перемещивания полученную реакционную смесь совмещают с водным раствором 4 г N,N-димeтилэтилендиамина (1:1). рН 7,8 устанавливают с

помощью 2N раствора НС1. Охлажденную реакционную смесь перемещивают 2 час и центрифугируют. В образовавшемся растворе находится еще 320 мг трипсина, что означает, что 68% взятого в реакцию трипсина связывается с,водонерастворимой смолой. Полученную водонерастворимую смолу N-TpHHcaiia смешивают с двойным объемом порошка целлюлозы Целлекс ХФ, после чего выливают в охлал):денную до О-4°С колонну и затем пробуферным раствором, состоящим из 0,1 М триэтаноламина, 0,1 М поваренной соли и 0,01 М хлористого кальция и с рН 7,8, пока в промывочной жидкости больше не будет обнаруживаться трипсин. Аналогично смолу isf-трипсина получают при использовании вместо МуЫДиметилэтилендиамина других амиНОВ;

Пример 2. Выделение ингибиторов с помощью смолы N-трипсина.

а)Специальный ингибитор трипсина из панкреатических желез свиней.

Экстракт, образующийся при обработке высокомолекулярного белкового вещества из панкреатических желез свиней 3%-ной перхлоркислотой, содержит ингибитор, удельная активность которого составляет 0,014 ImU на 1 мг биурет-протеина. 1 ImU для трипсина ингибирует около 1 мг Тгуриге Novo R.

Смолу N-трипсина, полученную из 10 г трипсина, прибавляют к нейтральному раствору, содержащему ингибитор (2,14 л, 745000 ImU для трипсина), при охлаждении до температуры О-4°С. После медленного перемещивания в течение 2 час при температуре О-4°С реакционную смесь центрифугируют, отбрасывая жидкую часть. Образовавщийся нерастворимый комплекс ингибитора со смолой трипсина после этого трижды перемешивают с соляно-буферным раствором, содержащим в своем составе 0,1 М триэтаноламина, 0,1 М поваренной соли и 0,01 М хлористого кальция, при температуре О-4°С и образовавшуюся при центрифугировании жидкую фазу вновь отбрасывают. Затем комплекс со смолой вносят в 0,2 М раствор хлористого калия, величину рН суспензии устанавливают равной 2,0 путем добавления соответствующего количества 2 N раствора НС1 и после добавления соляной кислоты реакционную массу перемешивают при охлаждении в течение 1,5 час. Наконец, вышеуказанную суспензию снова центрифугируют и образовавшийся остаток, состоящий из смолы-энзима и смолыкомплекса, еще один раз, как это описано выше, обрабатывают 0,2 М раствором хлористого калия с соляной кислотой, рН которого равно 2,0. В объединенных жидких фазах, образовавшихся в результате центрифугирования, находится такое количество ингибитора, которое составляет 68,5о/о взятого для выделения количества. Удельная активность препарата ингибитора составляет 0,32 1ши/.иг биуретпротеина, а после отделения соли на колонке, наполненной Сефадексом -- Г-25 (ДекстранГель фирмы Фармакиа, Уппсала, Швеция), Она составляет 2,73 ImU/жг биурет-иротеина.

Вымывание при использовании N-смолы происходит в значительно менее кислой области, чем для Л-смолы.

б)Поливалентный калликреиновый ингибитор из органов крупного рогатого скота.

тора трипсина из панкреатических желез свиней с использованием смолы N-трипсина. Исходным материалом для получения вышеуказанного ингибитора служит технический ингибитор на основе калликреина. При использовании смолы N-трипсина образуется с выходом 86% чистый калликреиновый ингибитор с удельной активностью 3,75 ImU/жг биуретпротеина.

в) Ингибитор из бобов сои.

Трипсин - химотрипсин-ингибитор из бобов сои (мол. вес. продукта 23000) получают и концентрируют аналогично описанному выше.

Исходным препаратом технический препарат ингибитора (ингибитор из бобов сои, практически лиофильный, фирмы Серва, Гейдельберг) с удельной активностью 0,36 ГтиДчг биурет-протеина для трипсина. 149400 mU

для трипсина полностью связываются на нейтральной сЙ10ле N-трипсина, полученной из 5 г трипсина. После одночасового перемешивания комплекса N-трипсиновая смола-ингибитор в 0,3 М буферном растворе хлористый калийсоляная кислота в жидкую фазу, образующуюся после центрифугирования, переходит 135000 ImU, что составляет 90% связанного количества. Удельная активность выделенного из бобов сои ингибитора после отделения солей при прохождении через колонну, наполненную Сефадексом - Г-25 (120X3 сл1) и промываемую 0,1 М буфером на основе коллидинацетата с рН 8,0 составляет 2,0 ImU//.is биурет-протеина, что соответствует приблизительно 6-кратному концентрированию.

Пример 3. Получение водонерастворимой ингибитор- (тразилол R) -смолы.

Для получения анионной А-смолы к 23 мл 0,2 М фосфатного буфера с рН 8,0 и 2,0 игл

0,1о/о-ного раствора гексаметилендиамина (ГМД) добавляют 120 мг смолы ЕМ А-81 или ЕМА-31 фирмы Монсанто, гомогенизируют в течение непродолжительного промежутка зремени, затем перемешивают и через 5 мин (при

использовании смолы ЕМА-31 через 3 мин после добавления смолы совмешают с раствором 200 (около 600000 ImU для трипсина) трипсин-калликреинового ингибитора в 30 ли вышеуказанного фосфатного буфера. Реакционную смесь перемешивают 16 час в холодильнике, затем центрифугируют и определяют несвязанное количество, ингибитора в жидкости, образовавшейся в результате центрифугирования. Осадок после центрифугирования представляющий собой смолу - ингибитор, многократно промывают 0,2 М триэтаноламинным буферным раствором с рН 7,8 до тех пор, пока промывные воды не будут содержать в своем составе ингибитор. Все вышеперечисленные операции производятся при температуре О-4°С.

Для синтеза нейтральной N-смолы все исходные компоненты используются такие же, как указано выше. Через 8 мин после добавлы (марки ЕМА-81) к полученному раствору дополнительно прибавляют раствор 1,6 г М,М-диметилэтилендиамина (КЫД) в небольшом количестве воды (объемное соотношение 1:1 с рН 1,8, устанавливаемым с помош,ью 2N соляной кислоты. Полученную реакционную смесь перемешивают 2 час и центрифугируют. Образовавшуюся в результате центрифугирования нерастворимую смолу-ингибитор повторно обрабатывают, как указано выше. Свойства N-смолы, при получении которой добавление хлоргидрата Ы,М-диметилэтилендиамина производится не через 8 мин, а уже через 5 мин к реакционной смеси, состоящей из смолы с ингибитором, представлены в табл. 1.

Таблица 1

Адсорбция и диссоциация трипсина и химотрипсина на анионных (Л) и нейтральных ингибиторных смолах.

Адсорбция. Ингибиторную смолу добавляют к 20 мл 0,1 М триэтаноламинного буферного раствора с рН 7,8, в состав которого помимо аминного компонента входят еш.е 0,1 М хлористый натрий и 0,01 М хлористый калий и после этого совмеш;ают с избытком- энзима, растворенного в небольшом количестве указанного буферного раствора. После перемешивания полученной реакционной смеси в течение 2 час (возможно также в течение ночи) ее центрифугируют и затем определяют оставшееся количество энзима в образовавшейся жидкой фазе. Нерастворимый комплекс-смола промывается буферным раствором с рН 7,8, до тех пор, пока в промывных водах больше не будет наблюдаться энзймзтической активТрипсин

Химотрипсин В расчете на количество энзима, которое 25 ингибируется в растворе таким же количеством ингибитора.

ности. Все вышеперечисленные операции проводятся при температуре О-4°С.

Диссоциация и элюирование. После последней операции промывания нерастворимый

комплекс энзима с ингибиторной смолой суспендируют в 50 лгл 0,3 М раствора хлористого калия и необходимую величину рН суспензии устанавливают с помош,ью 2 N раствора соляной кислоты. После 2 час перемешивания суспензию, которая имеет кислую реакцию, вновь центрифугируют и определяют энзиматическую активность жидкой фазы, образовавшейся при центрифугировании. Для: совершенно полного вымывания энзима из

смолы промывку производят, как правило, 3- 4 раза порциями по 50 мл, пока в жидкой фазе, образующейся при центрифугировании, больше не будет обнаруживаться заметное количество энзима (табл.2).

Таблица 2 Для концентрирования калликреина с помощью нейтральной ингибиторной смолы (NS и NS) перед адсорбцией растворяют калликрейн в 20 лгл 0,1 М триэтаноламинного буферного раствора, который дополнительно

ингибиторную смолу вносят в указанный раствор калликреина. После 14 час перемешивания (обычно в течение ночи, но в то же время вполне достаточно 2 час перемешивания) центрифугируют полученную реакционную смесь и производят определение несвязанного калликреина в жидкой фазе, образовавшейся при центрифугировании. Нерастворимый комплекс калликреина и ингибиторной смолы промывается буферным раствором до полного освобождения от калликреина и протеина.

Для трипсина 1 ImU ингибирует около 1 мг трипсина и соответствует 0,27 мг чистого ингибитора и 0,38 мг нашего препарата ингибитора.

1 КЕ (биологическая единица калликреина) выделяет около 0,7 мг протеина чистого калликреина.

В расчете на количество энзима, которое ингибирует такое же количество ингибитора в растворе.

Смола N-тринсин получена в соответствии с описанием данного изобретения; смола Атрипсин получена аналогично, однако без добавления Ы,М-диметилэтилендиамина.

10

Элюирование калликреииа из комплекса калликреина с ингибиторной смолой производят с помощью 0,38-1 М раствора соли гуанидина, который доводится до необходимого значения рН буфером на основе ацетата натрия. Для полного вымывания калликреина его комнлекс со смолой необходимо перемешивать от 4 до 5 раз порциями по 20 мл с раствором соли гуанидина в течение 1 час и после этого отделить центрифугированием ингибиторную смолу. Результаты приведены в табл. 3.

Таблица 3

Предмет изобретения

Способ выделения полипептидов путем взаимодействия полипептида-(I) с растворимым или нерастворимым носителем, обработки образующегося продукта в водной среде раствором полипептида, образующего с полипептидом-(I) комплекс, очистки комплекса промыванием, переведением комплекса в диссоциированное состояние действием кислого буфера и элюированием целевого продукта, отличающийся тем, что продукт взаимодействия полипентида-(1) и носителя обрабатывают алифатическим и/или ароматическим полиамином с одной свободной аминогруппой и защищенными ацильными остатками остальными аминогруппами.