Способ получения цефалоспорина с Советский патент 1976 года по МПК C12D9/04 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕФАЛОСПОРИНА С

Изобретение отнсслгся к области микробиогогий, к полученилО витибиотнков. Известен с;;особ подучеиия цефалоспорина С, закпючающийс : в TOM, что игтамм 8650 культзгрь Серь.alosporiuTf 49137 (АТСС 14553) выращивают в аэро ных условиях на cpet.e. содержащей источники углерода, органкческие источ1шки азота и сер), а также г-.:.ивральнх- 1е соли, при в течение 7О час с последующим вы делением целэвого продукта извест1Ш ми приемами. Однако известный способ не обеспечивает высокого Бьгхода целевого родукта. С делью повьииен;-.гя выхода аитибиотика, используют штамм Cephalospoyiym sp-Г 12 (АТСС 2O339).Cepbalospo-rium spштамм Р 1 Г, является мутантом Ceptiolosporluii; ж л-ТСС liSSOs хранится в Американской коллекции культур за номером АТСС 2О339 и в Центральном бюро плесневьзх культур з Баарке. Нидерпакды (Голлаьщия) под номером CBS 53571.Се 5ЪаiosporisjTT. sp-штамм F 12 обладает следу ющими свойствамн. Колонии вьращивают при 2О С в темноте, а затем для образования пигмента на свету в течение 2 дней. После инокулирова кия через 12 дней производят макроскопические и микроскопические исследования ( т. е. после 1О дней роста в темноте и 2 дней на свету). А. Макроскопические свойства, 1.Агар на овсяной муке. Колонии достигают диа1м5етра 13-1S мм за 12 дней, плоские белые или светло-желтые с очень тонко скрученной поверхностью и дрожжевидным внешним видом, края регулярные, несплошные, несколько свободные, растительнь й мицелий белый. 2.Агар на солодовом экстракте. Колокии диаметром 12-14 мм на 12-и день, плоские5 светло-коричневые или светло-желтые с ТОН14ИМИ радиальными завитками, дрожлсеподобные, края рег лярные5 несплошные, свободные, растителыап мицелий кре- мово-же/пъ; и. 3.Агар ка карто41еле - моркови. Вид такой же, как у ai-apa на овсяной муке, но окраска темнее. 4.Сабораудный агар. Колонии достигаю диаметра 1О-13 мм через 12 дней, такого цвета, как у агара на солодовом экстр те, с заметными радиальными витками, не которые из которых углублены около цент многие, меньшие по размеру, у края колон края почти сплошные, не совсем круглые. 5.Агар на кукурузной муке. Колонии достигают диa лeтpa 15-18 мм через 12 дней, плоские, белые или светло-зеленые, дрожжевидные, регулярные, но несколько свободные края, растительный мицелий такого же цвета. Ни Б одной из растительных сред не наблюдают образование диф4ундируемого пигмента. Б. Микроскопические свойства. Наблюде1ше поверхности колоний показы вает, что во всех растительных средах др жеподоб1 ый вид объясняется почти полным отсутствием воздушного мицелия, единственными воадушнь1ми структурами являются конидифоры, которые возникают прямо из непрерывной поверхности базального ми целия, Базальный минелий состоит из разветвленных, разделенных стенками швов ш риной 2-3 мкм. Фиалиды простые, поднимающиеся под прямым углом с базальных швов (ортофиа лиды), иногда имеющие поперечные перегородки близ их основания. Длина их 20-55, ширина 1,4-2,1 мкм в основании, сужаются к верхнему концу до 0,7-154 м Нет утолщенных стенок, проба на хромофильные свойства базальной части фиалид отрицательна. Конидии собираются вместе в почти круглые слизистые головки на концах фиалид. Они однополярные, двухкоиусные, ино да слелка искривленные. Выршаивание культуры ведут в глубинных условиях питательной среды при 2О-З Источником углерода в питательной среде могут быть такие углеводы, как глю коза, сахароза, галактоза, лактоза, фруктоза, декстрин, растворимый и нераствори мый крахмал и свекловичная меласса. Углево ды в питательную среду вводят в виде см си МОНО-, /щ и полисахаридов. Концентрация углеводов в питательной среде должна быть 2-1О вес.%. В питательной среде должны быть глинериды или гидролизованные глицериды, например оливковое, арахисовое, кукурузное масло. Количество глицеридов или про дуктов их гидролиза в питательной среде 1-8 вес.%. Питательная среда содержит также органический источник азота, которым служит растительный или животный протеин или продукт его разложения или гидролиза, например полипептиды, пептон, триптон или аминокислоты. Органическим источником азота является мука из семян, рыбная, мясная, маисоваЯ; пшеничная мука, мука бобовых, дрожжевой экстракт, мясные экстракты. В качестве неорганической соли в питательной среде могут использовать углекис- льпй кш1ьций, буру уксуснокислый аммоний, сульфат аммония или фосфаты щелочных металлов. Эти соли содержатся в питательной среде в количестве 0,5 - 1,5 вес.%, способствуют лучшему биосинтезу цефало- спорина С. В качестве орга1шческого источника серы используют метионин в количестве 0,5- 2,5 вес.%, а также серусодержащие органические соединения такие как тиогпиколевая кислота, тиоуксусная кислота, метилТйогликолят4 метилтиоацетат, они содержатся в питательной среде в количестве О,О5- 1 вес.%. Способ получехжя цефалоспорина С осуществляют следующим образом. Сначала культуру выращивают на скошенной агаризованной среде (косом агаре), содержащей среду для выращивания, в течение 1О-15 дней при 28-ЗО С. Выращенный мицелий промывают водой и полученный раствор использун5Т в качестве посевного материала для посевной среды. Посевцую среру выдерживают в аэробных условиях при перемешиваш{К при 25-ЗО С в течеш е час. Полученную посевную среду используют цпк инокуляции конечной среды выращивания и в конечную среду выращивания вносят в количестве 5 вес.% от веса ферме1тгационной среды. Выращивание в инокулированной конечной среде осуществляют в течение 96-13О час при 2О-30, цредпЬчтительно 22-28 С. Выход полученного цефалоспорина С определяют спектрофотометрически или микробиологически. Способ осуществляют в виде непрерывного процесса. Периодически отбирают (выводят) часть ферментационного бульона и в культуру вносят соответствующий объем свежей среды. Обычно это делают после начального периода выращивания (культивирования) 75-11О час. Свежие питательные вещества вводят в систему при помощи непрерывно действующего насоса, а количество элюе1гга регулируют таким образом, чтобы обеспечить постоянство рабочего объема и плотности популяции в фер- мен.гере. Степень разбавления непрерывной культуры поддерживают 0,2-0,8, предпочтительно O, объема/день.

Цефалоспорин С выделяют из культурной жидкости обычными способами, полученную неочищенную ферментационную смесь очищают фильтрацией, пропусканием через активированный уголь, адсорбцией на ионообменной смоле, элюированием водным основанием, например пиридином, и упариванием растворителя до получения кристаллического вещества.

Пример 1.В аэрируемый ферме тер из нержавеющей стали {с мещалкой)

емкостью 27 л вносят питательную среду следующего состава, ч:

Арахисовая мука60

Крахмал

Метилолеат

Ляр ДОЙЛЬ60

Сахароза

D -Глюкоза

Углекислый кальцийЮ

БураO.S

BL -Метионин15

ВодаДо 1000

рН среды доводят до 7,2-7,8 и среду стерилизуют паром при 12О С в течение 25-ЗО мин.

Ферментер затем инокулируют 5-10 об, % культуры Сepbalospori urn sp.штамм Г 1 полученной инокуляцией спор микроорганизма в среду следующего состава, %: Лярдойль 0,1 Замочная жидкость маиса (пшеницы) 2

Ниже приведен выход цефалоспорина С (ьйкт/г-лл собранной среды).

Выход цефалоспорина С1ОО10О16О1ОО

Ацетат аммония0,6

Сахароза2

и инкубацией инокулированной среды в аэрируемой копба в 7 час при .

Инокулированный ферментер, содержащий питательную среду, выдерживают 13О час при 22-28°С и в течение этого периода поддерживают уровень аэрации в 1л/мин при перемешивании со скоростью ЗОО45О об/мин. Полученная культура содержит 45ОО-5ООО мкг/мл цефалоспорина С (среднее значение).

Пример 2. Рост с 1 дм косого агара культуры Ceptialosporium $р.штамм F 12 суспендируют в 5 мл стерильной воды и используют для инокуляции 5ОО мл посевной среды, следующего состава, ч.: Замочная маисовая жидкость 25 Сахароза2О

Ацетат аммония4,5

Лярдойль0,5

ВодаДо 1ООО

Затем инокулированную среду инкубируют при 24-28°С в качалке с 22О об/мин 3 течение 72 час в присутствии различных соединений серы в количестве одного эквивалента серы (0,01 моля в 1ООО мл). Затем по 6О мл каждой из сред (I-IV ), с1риведеш1Ь5х в табл. 1 инокулкруют полученной вегетативной средой и выдерживают 114 час при 22-28 С в колбе-качалке с 25О об/мин.

Таблица 1

IИ1И|У

Пример 3. Инокулируют посевной средой, полученной в примере 2, 6О мл среды следующего состава, ч. : Арахисовая мук я60

Крахмал4О

Метиололеат6

Лярдойль6О

Сахароза5

Церелоза7

Углекислый кальций1О

Бура0,5

DL -Серин2

Тиоуксусная кислота1

ВодаДо 10ОО

Инокулированную среду инкубируют при 22-28°С Б колбе-качалке с 250 об/мин в течение 1ОО час и получают бульон, содержащий 330-36О мкг/мл цефалоспорина

Пример 4. Повторяют опыт примера 1, но берут питательную среду следующего состава, ч:

Арахисовая .vryKa3

КрахмалВО

Метилолеат25

Сахароза5

Гл го коз а7

Углекислый кальцийЮ

Бура0,5

DL Метионин15

ВодаДо 1ООО

Г1ол -ченная культура содержит 4500 5ООО кг/мл цефалоспорина С.

П р и м ер 5. В аэрируемый ферман- тер из нержавеющей стали с мещалкой емПродоляхит ель ностъ Быращив анкя,, час

к

82 116 14О 164 188 213 236 260 284 308 332

костью 27 л вносят питатехгыую среду следующего состава, ч :

6О 40 25

ука

5

7 1О

кальций

0,5

ин 15 1ООО

До

рН доводят до конечного значения 7,2- 7,8 и среду стерилизуют паром при 12О С в течение 20 мин. Ферментационную среду инокулируют 5-10 об.% культуры Cepttalosporiy-msp-, полученной инокуляцией спор микроорганизма в следую и,ую среду (части на 1ООО):

Лярдойль

1

Замочная лсидхость маиса 2О

6

Сахароза 2О

к инкубацией шгокулированной среды в аэ рглэуемой колбе 72 час гфи 28-ЗО С,

Икокулированный ферментер,, содержащий пнтателыдао среду, выдерживают 92 час при 22-28 С. В культурапьш тй котел подают культуральную среду из расчета 260 мл/чаСу так чтобы степень разбавлени достчггла О 25 объел1:/день. Температуру

выдерживают в интервале 22 24-С, перемешивают со скоростью 35О об/мин, поддерхшвают уровеггь аэрации OjS-l л/мин в течение всего процесса Быращйва1шя. За 15 диен от начала непрерывного процесса собираю-т 93,6 л среды с концентрацией цефалоспорина С. указанной в табл. 2.

Таблица

онцентрация цеалоспорина С, ;-лкг/мл

2180

2090

2260

2010

2375

2400

2130

221О

2175

2200

2190

5218 9

11родолла;гельнос1Ь вьфашивания,

час

35620ОО

38О2260

4О4219О

4282290

4522070

Собранный o6beivi О, на всех последующих этапах - 6240 мл.:

Формула изобретения лерода, азота и минеральные соли, с послеСпособ получения цефалоспорина С, пу-повышения выхода антибиотика, используют

М выращивания культуры рода Cephatos- ; штамм CephaLosporium sp.F 12 (АТСС riuTn на среде| содержащей источники уг-20339).

.7 К.)

ПрСДси/жение табл. 2

Кониентрация iie-j фалоспорина С, j

мкг/ мл

.дующим выделешш.м целевого продукта, 20 отличающийся тем, что, с целью