Модифицированный макропористый кремнезем в качестве носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии белков и способ его получения Советский патент 1976 года по МПК C07K1/16 

тил-2-этокси-3-тиолан-4-метил - 5-она ic первичным амином, приводящее к получению амиД01В а-меркаптокарбоновых кислот, а также использование модифицированного кремнезема для иммобилизации ферментов.

Однако ами ноалкилнр01ванный кремкезем не подвергался модификации 1-оксо-2-этокси-3тиолан-5-онО:М и в качестве носителя для дисульфидно-обменной ковалептной хро-матографии белкою не исиользовался.

.Целью предлагаемого изобретения является получение носителя для дисульфидно-обмепной ковалентной хроматографии белков с улучшенными физико-механическими и биологическими С1ВОЙ€Т|Вами, а также разработка способа его получения.

Эта цель достигается использованием в качестве носителя для дисульфидно-обменпой ковалентной хроматографии белков химически модифицированного макропористого кремнезема, содержащего на поверхности группу

-( Ш - СО - S - S - ,/

. /

Отличительными признаками описываемого носителя для дисульфидно-об.менной ковалентной хроматографии белко1В является использование ;В качестве матрицы макропористого

ЧСНг)зЖг С Н5-оХ

4cH,)-3W-co-CH,SH.rVs-s- r

Lra .V -мн пл rw ;

- LclnTV pJH-(и -Clio о-s- //

v л/лL .

ПриМер 1. Получение носителя для дпсульфидно-обме1нной ковалентной хроматографии белков.

3 г аминоалкилированного 1макропористого кремнезема еуспендпруют в 10 мл сухого бензола, добавляют 0,5 мл 1-оксо-2-этокси-3-тиолап-5-она (т. кип. 76°С при 1 ммрт. ст.; п ц° 1,4805) и перемешивают 6 часов при комнатной температуре. Растворитель отделяют декантацией, твердую фазу промывают бензолам (3X20 мл) .спиртом (ЗХ20 мл), деиониЗ01ван1ной водой (20 мл), буферным раствором (0,1М-Трис-НС1 - 1 мм этилендиаминотетрауксуюная кислота (ЭДТА), рН 8,0) и суспендируют е 10 МЛ указанного буфера. К суспензии добавляют 5 мл раствора 0,5 г 2,2 дипиридилдисульфида в диметилформамиде и перемещивают реакционную смесь 6 час при комнатной температуре. Жидкую фазу отделяют, носитель промывают сухим бензолом (100 мл), водой (100-мл) и абсолютным спиртом (200 мл); целевой продукт сушат в вакремнезема, а в качестве привитых групп группы

-(CH,t3№-CO-CH,-S-S-( }

NСпособ получения модифицированного макропористого кремнезема, содержащего ла поверХНости группу

-{СН2 31Ш- СО - CHj- S - S -/

заключается в том, что макропористый кремнезем, модифицированный 73 ;оиропилТ:риэтсксисиланом, подвергают взаимодействию с 1-оксо-2-этокси-3-тиолан-5-оиол1, предпочтительно взятом в пятпкратпом избытке по отногпению к аминогруппам носителя, IB среде инертного органического растворителя, например бензола, с последующей обработкой полученного продукта 2,2-дипиридилдисульфидом в водноорганической среде при рН 7,2-8,5.

Для ускорения этой реакции 2,2-дипиридилдисульфид желательно брать в пятикратном избытке по отношению к числу SH-групп носителя в виде концентрированного раствора в смещивающемся с водой органическом растворителе, например диметилформамиде, диоксане, спирте.

Процесс протекает по следующей схеме:

- .

куум-эксикаторе пад . Количество активных к дисульфидному обмену групп, определенное спектрофотометрированием выделившегося при исчериываюидем восстановлении навески носителя 2-тиопиридона, составляет 40 ммоль - S-S-групп па 1 г полученного носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии.

Пример 2. Использование носителя для дисульфидно-обменкой ковалентной хроматографии при очистке лизоцима белка куриных яиц. 10 мл раствора буфера (0,1-М трис-НС1 - 0,15 М -Ма-додецялсульфат - 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), содержащего 50 мг лизоцима белка куриных яиц (марки В), восстановленного в денатурирующих условиях (2-меркаптозтаноло.м в присутствии Na-додецилсульфата) и освобожденного от избытка восстанавливающего агента гельхроматографией, в сосуде с мешалкой вводят в контакт с 1 г носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии и перемешивают 3 час при комнатной